一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物及制备方法技术

本发明专利技术公开一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物，包含心血管前体干细胞，心血管前体干细胞表面融合了血小板膜纳米囊泡PNV。本发明专利技术利用人体血小板膜糖蛋白受体天然向缺血心肌及粥样病变缺血血管靶向归巢的生物学特性，制备了血小板膜纳米囊泡PNV，并利用PNV包被心血管前体干细胞，制成干细胞药物。PNV不仅保留了血小板膜上的糖蛋白受体，可感知多种危险信号分子，且PNV不具有触发激活凝血的机制，是一种天然安全的靶向导航物质，可携带血管前体干细胞靶向归巢缺血病变心肌血管，实现对受损心肌血管精准修复的目的。本发明专利技术进一步采用Flk‑1+细胞、动脉外膜周细胞(APC)两种血管前体细胞及配合WJMSCs，能直接分化成具有血液灌注功能的血管。

【技术实现步骤摘要】
一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物及制备方法
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物及制备方法。
技术介绍
血管病变所致的缺血性疾病如：冠心病、脑梗塞、肢体缺血性坏死，乃至眼缺血性失明...等，迄今为止，一直是世界死亡、致残原因之首。现代医学以药物、介入、手术、器官移植等手段均未能根本改善其预后。21世纪干细胞再生医学虽带来了新机。但遗憾的是，由于移植的细胞能够到达病变器官组织的很少，存留时间短，24h存留不及5-10％，这对干细胞修复心肌再生血管的实现产生极大障碍。如何将移植的干细胞靶向归巢于缺血的心脏及血管，又能创伤小、安全适用于临床，是当前医学所面临的难题。国际上开展的干细胞靶向心肌的研究方法已有多种，如：早期应用双面抗体连接心肌损伤时短暂表达的肌球蛋白轻链(anti-MLC1)，及anti-CD90连接MSCs。但由于抗体FC存在，很容易在体内被免疫细胞吞噬，故效果差，易激发免疫反应。此外，还有研究采用外加磁场引导干细胞归巢的方法又受限于环境条件等。最近的基因修饰方法表达单链抗体连接的方式，仍存在因基因导入DNA导致DNA突变的风险。因此，迄今为止，尚没有安全可靠的方法可以解决外源输入的干细胞靶向归巢到缺血心肌血管的问题。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题为了解决现有技术的上述问题，本专利技术提供一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物，其所含干细胞为经血小板膜纳米囊泡(PlateletNanovesicles，PNV)包覆的心血管前体细胞，该血小板膜纳米囊泡为心血管前体细胞提供了导航作用，携带着干细胞靶向归巢缺血病变心肌血管。此外，由于制备的血小板膜纳米囊泡(PNV)表面表达CD42b(GPIbα)，CD41(GPIIb/IIIa)受体，去掉了血小板膜内的凝血信号系统。因此，不会触发及激活血小板介导的凝血机制，无促血栓形成等不良反应及风险。无凝血触发机制，但保留了血小板膜上糖蛋白受体，能感知多种危险信号分子，因而构成了安全且天然生物导航系统，促进移植的细胞靶向归集到缺血病变心肌血管，促成干细胞修复心肌再生血管。本专利技术还进一步包括上述融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物的制备方法。需要说明是，所述干细胞药物为任何能够保证干细胞活性并达到病变器官组织的剂型，包括但不限于注射剂。(二)技术方案为了达到上述目的，本专利技术采用的主要技术方案包括：一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物，其包括：心血管前体干细胞，所述心血管前体干细胞表面包被了血小板膜纳米囊泡PNV；其中，所述血小板纳米囊泡保留了血小板膜上糖蛋白受体，去掉了血小板膜内的凝血信号系统。根据本专利技术较佳实施例，其中：所述心血管前体干细胞包含华通胶间充质干细胞WJMSCs、动脉外膜周细胞APC和动脉外膜Flk-1+细胞。根据本专利技术较佳实施例，其中：所述动脉外膜周细胞APC和动脉外膜Flk-1+细胞是以新生儿遗弃的脐带为材料来源，从脐动脉外膜中提取的人脐带动脉外膜Flk-1+细胞和人脐带动脉外膜周细胞APC。根据本专利技术较佳实施例，其中：在所述心血管前体干细胞中，人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞WJMSCs三者按细胞数量比为1∶40-60∶80-120混合。优选地，人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞WJMSCs三者按细胞数量比为1∶50∶100进行混配。根据本专利技术较佳实施例，其中：所述血小板纳米囊泡为从新生儿脐带血血小板中提取。根据本专利技术较佳实施例，其中：所述药物为注射液，所述注射液中还含有人血白蛋白，人血白蛋白在注射液中的质量浓度为0.2％～0.25％。根据本专利技术较佳实施例，所述注射液的规格为2mL/管，每管中细胞总数量为(1.5～2.5)×107。根据本专利技术较佳实施例，所述注射液还含有生理盐水，生理盐水为注射液的溶剂。另一方面，本专利技术还提供一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物的制备方法，其包括如下步骤：S1：血小板纳米囊泡(PNV)的制备；S2：心血管前体细胞CVPSCs的制备；S3：采用步骤S1制备的血小板纳米囊泡(PNV)融合步骤S2制备的心血管前体细胞CVPSCs，得到PNV-CVPSCs；S4：以该PNV-CVPSCs制成干细胞药物。需要说明的是，步骤S1-S2的顺序并不限制，只要完成血小板纳米囊泡PNV的制备、心肌血管前体细胞CVPSCs的制备即可。根据本专利技术较佳实施例，其中：步骤S1中，血小板纳米囊泡(PNV)的制备过程如下：S1-1：以新生儿脐带血为材料来源，先采用离心方法除去红细胞，制备富血小板血浆，再加入EDTA和前列腺素E1(PGE1)的PBS溶液，再次离心，沉淀分离血小板，向血小板加入EDTA的PBS溶液，并与蛋白酶抑制剂混合，-80℃下储存；S1-2：室温解冻血小板3500-4500g离心，用含蛋白酶抑制剂PBS溶液洗涤三次，用水重悬，使用水浴超声波仪在42kHz的频率和100W的功率超声处理4-6分钟后得到血小板纳米囊泡(PNV)，冻存。根据本专利技术较佳实施例，其中：在步骤S1-1和步骤S1-2之间还包血小板表面标志检测：对步骤S1-1的产物采用流式细胞术检测血小板表面标志CD42b(GPIbα)，CD41(GPIIb/IIIa)的表达。根据本专利技术较佳实施例，其中：在步骤S1-2之后还包括对PNV的形态学检查，蛋白质印迹分析(Westernblotanalysis)和免疫组化检测；具体地，对步骤S1-2的产物使用动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)，根据形态学检查结果表征PNV的存在；蛋白质印迹分析PNV的CD42b(GPIbα)，PNVCD41(GPIIb/IIIa)表达水平；免疫组化检测PNV表面标志CD42b(GPIbα)，CD41(GPIIb/IIIa)。通过前述检测，确认PNV表面表达CD42b(GPIbα)，CD41(GPIIb/IIIa)受体，表征着PNV制备成功。根据本专利技术较佳实施例，其中：所述心血管前体细胞CVPSCs包含华通胶间充质干细胞WJMSCs、动脉外膜周细胞APC和动脉外膜Flk-1+细胞；更优选地，其中动脉外膜周细胞APC和动脉外膜Flk-1+细胞是从脐动脉外膜中提取的人脐带动脉外膜Flk-1+细胞和人脐带动脉外膜周细胞APC。其中，当心血管前体细胞CVPSCs是由华通胶间充质干细胞WJMSCs、人脐带动脉外膜周细胞APC和人脐带动脉外膜Flk-1+细胞按比例混合组成时，其制备方法如下：S2-1：人脐带动脉外膜Flk-1+细胞的制备，其包括按顺序进行的如下步骤：从新生儿新鲜脐带中提取人脐带动脉外膜Flk-1+细胞，经纯化、3D培养、3D传代培养和低氧培养，以完成低氧培养后的Flk-1+细胞备用；S2-2：人脐带动脉外膜周细胞AP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物，其特征在于，其包括：心血管前体干细胞，所述心血管前体干细胞表面包被了血小板膜纳米囊泡PNV；其中，所述血小板纳米囊泡保留了血小板膜上糖蛋白受体，同时去掉了血小板膜内的凝血信号系统。/n

【技术特征摘要】
1.一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物，其特征在于，其包括：心血管前体干细胞，所述心血管前体干细胞表面包被了血小板膜纳米囊泡PNV；其中，所述血小板纳米囊泡保留了血小板膜上糖蛋白受体，同时去掉了血小板膜内的凝血信号系统。


2.根据权利要求1所述的一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物，其特征在于，所述心血管前体干细胞包含华通胶间充质干细胞WJMSCs、动脉外膜周细胞APC和动脉外膜Flk-1+细胞。


3.根据权利要求2所述的一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物，其特征在于，所述动脉外膜周细胞APC和动脉外膜Flk-1+细胞是以新生儿遗弃的脐带为材料来源，从脐动脉外膜中提取的人脐带动脉外膜Flk-1+细胞和人脐带动脉外膜周细胞APC。


4.根据权利要求3所述的一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物，其特征在于，在所述心血管前体干细胞中，人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞WJMSCs三者按细胞数量比为1∶40-60∶80-120混合。


5.根据权利要求1-4任一项所述的一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物，其特征在于，所述血小板纳米囊泡为从新生儿脐带血血小板中提取。


6.根据权利要求1所述的一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物，其特征在于，所述药物为注射液，所述注射液中还含有人血白蛋白，人血白蛋白在注射液中的质量浓度为0.2％～0.25％。


7.一种融合PNV靶向缺血心肌血管的干细胞药物的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
S1：血小板纳米囊泡PNV的制备；
S2：心血管前体细胞CVPSCs的制备；
S3：采用步骤S1制备的血小板纳米囊泡PNV融合步骤S2制备的心血管前体细胞CVPSCs，得到PNV-CVPSCs；
S4：以该PNV-CVPSCs制成干细胞药物。


8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，血小板纳米囊泡PNV的制备过程如下：
S1-1：以新生儿脐带血为材料来源，先采用离心方法除去红细胞，制备富血小板血浆，再加入EDTA和前列腺素E1(PGE1)的PBS溶液，再次离心，沉淀分离血小板，向血小板加入EDTA的PBS溶液，并与蛋白酶抑制剂混合，-80℃下储存；
S1-2：室温解冻血小板3500-4500g离心，用含蛋白酶抑制剂PBS溶液洗涤三次，用水重悬，使用水浴超声波仪在42kHz的频率和100W的功率超声处理4-6分钟后得到血小板纳米囊泡(PNV)，冻存。


9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1-2之后还包括：形态学检查、蛋白质印迹分析和免疫组化检测；
形态学检查是指对步骤S1-2的产物使用动态光散射和透射电子显微镜，根据形态学检查结果表征PNV的存在；
蛋白质印迹分析PNV的CD42b(GPIbα)，CD41(GPIIb/IIIa)表达水平；
免疫组化检测PNV表面标志CD42b(GPIbα)，CD41(GPIIb/IIIa)。


10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述心血管前体细胞CVPSCs是由华通胶间充质干细胞WJMSCs、人脐带动脉外膜周细胞APC和人脐带动脉外膜Flk-1+细胞按比例混合组成；
其制备方法如下：
S...

【专利技术属性】
技术研发人员：高连如，张宁坤，
申请(专利权)人：高连如，
类型：发明
国别省市：北京;11