一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液，其包含华通胶间充质干细胞WJMSCs、人脐带动脉外膜周细胞APC和人脐带动脉外膜Flk‑1+细胞。本发明专利技术是以新生儿遗弃的脐带为材料来源，从脐动脉外膜中提取Flk‑1+细胞和脐带动脉外膜周细胞APC，这两种细胞为血管再生提供了直接的、特有的两种前体细胞，再通过WJMSCs所补充、更新及构成的新生血管的细胞外基质成分，进一步形成血管再生信号系统调控下血管前体细胞向血管分化的再生微环境。将这三种干细胞按比例混合进行体外培养实验，结果证实在体外培养13天后成功形成了血管网。本发明专利技术的注射液可制成用于血管再生的注射剂，用于治疗缺血性心脏病、缺血性脑卒中、缺血性周围血管病等疾病。

【技术实现步骤摘要】
一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液及其制备方法
本专利技术涉及生物医用材料
，尤其是一种包含了多种血管再生属性的干细胞的注射液及其制备方法。
技术介绍
血管病变所致的缺血性疾病如：冠心病、脑梗塞、肢体缺血性坏死，乃至眼缺血性失明…等，迄今为止，一直是世界死亡、致残原因之首。现代医学以药物、介入、手术、器官移植均未能根本改善其预后。21世纪干细胞再生医学虽带来了新机，但种子细胞再生血管的特异性、功能性、安全性大大制约了干细胞再生血管理念的实现。目前，具有全分化潜能的胚胎干细胞(ESC)、诱导型多能干细胞(iPS)，虽可再生血管，但ESC涉及伦理及致畸胎瘤，iPS涉及致肿瘤风险，均不能用于临床。成体干细胞包括不同来源的间充质干细胞仅可通过旁/自分泌潜能有限地刺激血管再生。因为目前的研究发现，任何一种成体细胞如CD133、CD34，间充质干细胞等均无法再生形成具有血液灌注功能的血管。相关研究发现，动脉外膜是一个储存血管前体细胞巢(niche)。动脉外膜周细胞(Pericytes)是血管发生、发育、再生、稳定血管结构、调控血流、及调节局部免疫功能的关键细胞；动脉外膜Flk-1+细胞(血管内皮生长因子受体阳性细胞)是血管及心肌前体细胞，其直接参与及调控血管发生、再生；华通胶源间充质干细胞(WJMSCs)具有促血管再生的旁/自分泌功能，其分泌多种细胞因子如血管内皮生长因子、成纤维生长因子、肝细胞生长因子…等，并直接参与构建血管再生基质成分。2018年，西班牙Dr.Alvino首次应用冠心病搭桥患者余下的大隐静脉分离培养出血管外膜周细胞，并移植到猪心梗模型上，增加了血管及心肌灌注。但到目前为止，国际上仅提出了利用病人血管作为提取周细胞的来源。但很显然，从病人血管外膜取材非常困难、有创，难以推广。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题为了解决现有技术的上述问题，本专利技术提供一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液及其制备方法，三种血管再生属性干细胞分别为人脐带动脉外膜周细胞(APC)、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞和华通胶间充质干细胞(WJMSCs)，其中APC,Flk-1+细胞两种细胞由新生儿遗弃的脐动脉外膜中提取而来，为血管再生直接提供特有的两种前体细胞；WJMSCs来自脐动脉、脐静脉及脐带外膜之间的华通胶组织，用于补充、更新及构成新生血管的细胞外基质成分，进一步提供血管再生信号系统调控下血管前体细胞向血管分化的再生微环境。本专利技术的注射液可促进具有传送血液功能的小动脉/微血管，不仅实现了胚胎干细胞、诱导型多能干细胞等才能达到的再生血管功能，而且避开了ESC，iPS难以应用于临床的缺陷。(二)技术方案为了达到上述目的，本专利技术采用的主要技术方案包括：一方面，本专利技术提供一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液，其包含：华通胶间充质干细胞WJMSCs、人脐带动脉外膜周细胞APC和人脐带动脉外膜Flk-1+细胞。根据本专利技术较佳实施例，所述注射液还含有生理盐水，生理盐水为注射液的溶剂。根据本专利技术较佳实施例，所述注射液中，人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞WJMSCs三者按细胞数量比为1:40-60:80-120进行混配。优选地，人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞WJMSCs三者按细胞数量比为1:50:100进行混配。根据本专利技术较佳实施例，所述注射液中还含有人血白蛋白，人血白蛋白在注射液中的质量浓度为0.2％～0.25％。根据本专利技术较佳实施例，所述注射液的规格为2mL/管，每管中细胞总数量为(1.5～2.5)×107。另一方面，本专利技术提供一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液的制备方法，其包含如下步骤：S1:人脐带动脉外膜Flk-1+细胞的制备；S2:人脐带动脉外膜周细胞APC的制备；S3:华通胶源间充质干细胞WJMSCs的提取与培养；S4:将人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞WJMSCs按比例混合，用注射用水或生理盐水配制成注射液。需要说明的是，步骤S1-S3的顺序并不限制，只要完成人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、周细胞APC、华通胶间充质干细胞WJMSCs的制备即可。根据本专利技术较佳实施例，其中：步骤S4中，人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞WJMSCs三者按细胞数量比为1:40-60:80-120进行混配，优选是按1:50:100混配。根据本专利技术较佳实施例，其中：步骤S4中，取经低氧培养的第二代或第三代人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、WJMSCs分别加入生理盐水，在(100-200)g离心力离心洗涤细胞，弃上清，将细胞洗涤2-4遍，把三种细胞分别用生理盐水配成每毫升(1.5-2.5)×107浓度的细胞悬液，再按预定三种细胞数量比混合三种细胞悬液，用生理盐水补充至预定注射液规格；密封，即时使用，或4-8℃下保存，12小时内使用。根据本专利技术较佳实施例，其中；每管中的细胞总数量为(1.5-2.5)×107。通常在细胞使用时，按照人的体重计算，60公斤使用6×107的细胞数量，每管2×107细胞数量恰可取用三管，且根据体重的增减使用细胞的数量易于增减。为了使用细胞时注射器抽取顺畅，约2×107左右的细胞数量在2mL体积里属于恰当浓度，细胞浓度过高或过低均给使用和操作带来不便。根据本专利技术较佳实施例，其中：步骤S4中，制备注射液时，还加入了人血白蛋白，人血白蛋白的质量浓度为0.2％～0.25％，制备成每2mL、含(1.5-2.5)×107细胞数量为一个包装单位的注射液。加入人血白蛋白，作用之一是保证细胞间电荷平衡，防止细胞的聚集，其二是给生理盐水中的细胞提供适当的营养，维持细胞活性。根据本专利技术较佳实施例，其中：步骤S1包括按顺序进行的如下步骤：人脐带动脉外膜Flk-1+细胞的提取、纯化、3D培养、3D传代培养和低氧培养；其中，人脐带动脉外膜Flk-1+细胞是从新生儿新鲜脐带中提取，用于配制注射液的人脐带动脉外膜Flk-1+细胞为完成低氧培养后的Flk-1+细胞。根据本专利技术较佳实施例，其中：步骤S2包括按顺序进行的如下步骤：人脐带动脉外膜周细胞APC的提取、纯化、3D培养、3D传代培养和低氧培养；其中，人脐带动脉外膜周细胞APC是从新生儿新鲜脐带中提取，用于配制注射液的人脐带动脉外膜周细胞APC为完成低氧培养后的CD140和CD146双阳性细胞。根据本专利技术较佳实施例，其中：步骤S3包括按顺序进行的如下步骤：WJMSCs提取、纯化、3D培养、3D传代培养和低氧培养，其中WJMSCs是新生儿新鲜脐带中提取，用于配制注射液的WJMSCs是完成低氧培养后第二或第三代的WJMSCs。根据本专利技术较佳实施例，其中：步骤S1-S3还包括细胞冻存本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液，其特征在于，其包含：华通胶间充质干细胞WJMSCs、人脐带动脉外膜周细胞APC和人脐带动脉外膜Flk-1+细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液，其特征在于，其包含：华通胶间充质干细胞WJMSCs、人脐带动脉外膜周细胞APC和人脐带动脉外膜Flk-1+细胞。


2.根据权利要求1所述的注射液，其特征在于，所述注射液中，人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞WJMSCs三者按细胞数量比为1:40-60:80-120进行混配。


3.根据权利要求1或2所述的注射液，其特征在于，所述注射液中还含有人血白蛋白，人血白蛋白在注射液中的质量浓度为0.2％～0.25％。


4.根据权利要求1所述的注射液，其特征在于，所述注射液的规格为2mL/管，每管中细胞总数量为1.5×107～2.5×107。


5.一种包含三种血管再生属性的混合干细胞注射液的制备方法，其包含如下步骤：
S1:人脐带动脉外膜Flk-1+细胞的制备；
S2:人脐带动脉外膜周细胞APC的制备；
S3:华通胶源间充质干细胞WJMSCs的提取与培养；
S4:将人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞WJMSCs按比例混合，用注射用水或生理盐水配制成注射液。


6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中，人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞、华通胶间充质干细胞WJMSCs三者按细胞数量比为1:40-60:80-120进行混配。


7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中，取经低氧培养的第二代或第三代人脐带动脉外膜周细胞APC、人脐带动脉外膜Flk-1+细胞和WJMSCs分别加入生理盐水，在(100-200)g离心力离心洗涤细胞，弃上清，将细胞洗涤2-4遍，将三种细胞分别用生理盐水配成每毫升1.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：高连如，张宁坤，
申请(专利权)人：高连如，
类型：发明
国别省市：北京;11