一种皮肤修复液及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种皮肤修复液及其制备方法，属于皮肤修复技术领域。本发明专利技术所述皮肤修复液为脐带间充质干细胞来源的条件性培养液。同直接将间充质干细胞应用于治疗皮肤伤口相比，本发明专利技术所述皮肤修复液避免了与移植活细胞和细胞增殖相关的安全问题，如免疫相容性、致瘤性、传染性疾病的传播；且条件性培养基中的成分可采用类似于评估传统药物的方法来评估其安全性、剂量和效力；本发明专利技术所述皮肤修复液的生产和制造更加容易，并且可以通过冷冻干燥保存，易于包装和运输，治疗前无需耗时复苏及扩增干细胞等，便于使用。

A skin repair solution and its preparation

【技术实现步骤摘要】
一种皮肤修复液及其制备方法
本专利技术涉及一种皮肤修复液及其制备方法，属于皮肤伤口修复

技术介绍
皮肤作为机体主要的防护屏障，形态和功能完整的皮肤可以有效减少甚至避免有害理化因素对机体的损伤。皮肤创伤是一个日益严重的问题，已成为很大的健康和经济负担，由于烧伤、创伤、手术、辐射损伤、糖尿病等因素导致的皮肤创伤是现代医学面临的一项重大挑战。若皮肤创伤则容易发生感染，若形成慢性难愈创明将严重影响着患者的生活质量。因此，皮肤创伤必须得到快速而有效的治疗。目前治疗皮肤创伤的方法及手段有很多，但取得的疗效并不尽如人意。缺损局部的细胞增殖和迁移在的皮肤愈合过程中发挥至关重要的作用，皮肤创伤局部的细胞增殖受限和迁移受损是导致伤口延迟愈合甚至不愈合的重要原因。研究显示，间充质干细胞具有促进细胞增殖、迁移、促血管生成和抗炎症的作用，间充质干细胞的旁分泌作用是其发挥生物学效应的主要途径，现有方法均是直接将干细胞应用于治疗皮肤创伤，存在免疫相容性、致瘤性、传染性疾病的传播，长时间储存活细胞需要加入具有潜在毒性的冷冻保存剂。由此可见直接将干细胞应用于治疗皮肤创伤存在很大的局限性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种皮肤修复液，所述皮肤修复液为脐带间充质干细胞来源的条件性培养液。本专利技术的另一目的在于提供所述皮肤修复液的制备方法，具体包括以下步骤：(1)在二氧化碳培养箱中应用培养瓶培养人脐带间充质干细胞，使其密度达到90-95％。(2)用α-MEM培养基洗涤细胞后加入新的α-MEM培养基，继续在二氧化碳培养箱中培养，培养48h～96h后获取培养瓶中的上清液。(3)将收集得到的上清液分别倒入超滤离心管离心，经滤膜过滤后得到脐带间充质干细胞来源的条件性培养液，置于冰箱中保存备用。优选的，本专利技术步骤(1)中培养瓶为T-175培养瓶，培养基为α-MEM培养基，培养条件为：温度37℃，二氧化碳浓度为5％，饱和湿度。优选的，本专利技术步骤(2)中α-MEM培养基的加入量为40-45ml，培养条件为：温度37℃，二氧化碳浓度为5％，饱和湿度。本专利技术所述皮肤修复液的使用方法：局部涂抹，3次/日，每次用量：100μL/1cm2创面。本专利技术的有益效果：(1)直接将干细胞应用于治疗皮肤伤口相比，本专利技术所述皮肤修复液避免了与移植活细胞和细胞增殖相关的安全问题，如免疫相容性、致瘤性、传染性疾病的传播；且条件性培养基中的成分可采用类似于评估传统药物的方法来评估其安全性、剂量和效力。(2)长时间储存活细胞需要加入具有潜在毒性的冷冻保存剂，而长时间储存本专利技术所述皮肤修复液则避免了冷冻保存剂的使用，同时不易丧失其治疗效果。条件性培养基中的成分可采用类似于评估传统药物的方法来评估其安全性、剂量和效力。(3)本专利技术所述皮肤修复液能够避免侵入性的细胞采集过程，因此对于治疗疾病来说更经济、更实用；能够在可控的实验室条件下通过指定的细胞系进行大规模生产；可大大减少增殖和培养干细胞的时间和费用，并能够应对紧急需求，例如急性脑卒中、急性心肌梗塞或急性创伤等；用于治疗的条件性培养基可以通过修饰来达到预期的效果。(4)干细胞来源的条件性培养基的生产和制造更加容易，并且通过冷冻干燥保存，易于包装和运输，治疗前无需耗时复苏及扩增干细胞等，便于使用，此外，干细胞来源的条件性培养基中不含活细胞，可有效避免供体和受体之间不匹配而带来的免疫排斥问题；制备间充质干细胞的条件性培养基能获得富含间充质干细胞来源细胞因子、趋化因子等多种功能蛋白的溶液。附图说明图1为实施例1中划痕实验结果图。图2为实施例1中皮肤修复液的效果图。图3为实施例2中不同时间段所得脐带间充质干细胞来源的条件性培养液的划痕实验结果图。图4为实施例2中不同时间段所得脐带间充质干细胞来源的条件性培养液的的效果图。具体实施方式下面结合具体实施例本专利技术作进一步的详细说明，但本专利技术的保护范围并不限于所述内容。实施例1一种皮肤修复液的制备方法，具体包括以下步骤：(1)在T-175培养瓶中培养人脐带间充质干细胞，使其密度达到93％，其中培养基为α-MEM培养基，培养条件为：温度37℃，二氧化碳浓度为5％，饱和湿度。(2)洗涤并加入新的α-MEM培养基(α-MEM培养基的加入量为45ml)后继续在电热恒温二氧化碳培养箱中培养，培养完成后获取培养瓶中上清液。(3)将72h收集得到的上清液分别倒入超滤离心管离心，经滤膜过滤后得到脐带间充质干细胞来源的条件性培养液，置于-80℃冰箱中保存备用。划痕模型本实施例使用人永生化表皮细胞(humankeratinocytes，HaCaT)制作划痕模型，具体过程如下：在6孔板中分别加入72h收集的脐带间充质干细胞条件性培养基、α-MEM培养基、DMEM培养基，分别观察0～12h中HaCaT从划痕边缘向中心逐渐迁移的情况，如图1所示，结果显示：各组的细胞迁移距离不同，相比对照组结果，72h收集的条件性培养基能够显著加速HaCaT迁移，迁移的HaCaT几乎全部布满划痕区域，α-MEM组和DMEM组的细胞未见明显迁移；以上实验在细胞水平证明72h收集的人脐带间充质干细胞条件性培养液具有明显的促进角化上皮细胞迁移的效果。全层皮肤创伤裸鼠实验：利用SPF级BALB/C裸鼠构建全层皮肤创伤模型，创面缺损局部涂抹脐带间充质干细胞来源的条件性培养液评估其对皮肤创伤愈合的作用。(1)取SPF级BALB/C裸鼠(8周龄，体重15-20g，雄性)，随机分为脐带间充质干细胞条件性培养基组、α-MEM组(阴性对照组)、重组人表皮生长因子凝胶组(阳性对照组)。(2)腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉小鼠，麻醉满意后俯卧位固定于操作台上，背部皮肤用碘伏棉球消毒一次，随后用75％酒精脱碘一次。(3)铺无菌洞巾后，用灭菌的皮肤打孔器在裸鼠背部正中央靠下部位皮肤打孔(直径15mm)，制作全层皮肤创伤裸鼠模型。(4)分别吸取脐带间充质干细胞来源的条件性培养液、α-MEM、重组人表皮生长因子凝胶(EGF)，并将药物均匀涂抹于各组裸鼠皮肤创伤部位，每只裸鼠给与170μl/次，3次/天。(5)术后第0、3、6、9、12、15天用数码相机拍照记录每只裸鼠皮肤创伤愈合情况，如图2所示。在术后第15天时，观察到局部应用脐带间充质干细胞来源的条件性培养液组所有小鼠背部血痂均已完全脱落，皮肤创伤均已完全愈合，其余各组小鼠均可观察到背部皮肤创伤部位皮肤未完全愈合；证明在动物水平上条件性培养液对伤口修复具有很好的疗效，优于市面上的重组人表皮生长因子凝胶(EGF))。实施例2一种皮肤修复液的制备方法，具体包括以下步骤：(1)在二氧化碳培养箱中应用培养瓶培养人脐带间充质干细胞，使其密度达到90-95％。(2)用α-MEM培养基洗涤细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种皮肤修复液，其特征在于：所述皮肤修复液为脐带间充质干细胞来源的条件性培养液。/n

【技术特征摘要】
1.一种皮肤修复液，其特征在于：所述皮肤修复液为脐带间充质干细胞来源的条件性培养液。


2.权利要求1所述皮肤修复液的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)在二氧化碳培养箱中应用培养瓶培养人脐带间充质干细胞，使其密度达到90-95％；
(2)用α-MEM培养基洗涤细胞后加入新的α-MEM培养基，继续在二氧化碳培养箱中培养，培养48h～96h后获取培养瓶中的上清液；
(3)将收集得到的上清液分别倒入超滤离心管离...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒲磊，李亚雄，杨应南，刘博宇，张静，孟平，张雅永，韩燊，
申请(专利权)人：昆明市延安医院，
类型：发明
国别省市：云南;53