小鼠脐带间充质干细胞在保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种小鼠脐带间充质干细胞在制备保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物中的应用；并涉及一种制备保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物的方法。实验证明小鼠脐带间充质干细胞有效改善小鼠烫伤后血脑屏障通透性的改变。

Application of mouse umbilical cord mesenchymal stem cells in protecting blood brain barrier function after skin scald

【技术实现步骤摘要】
小鼠脐带间充质干细胞在保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的应用
本专利技术涉及免疫学领域，具体涉及一种小鼠脐带间充质干细胞在保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的应用，特别是在小鼠皮肤烫伤后的血脑屏障功能保护的应用。
技术介绍
间质干细胞最初是特指骨髓基质细胞，后来研究发现在胎儿肝脏、肺脏、心脏等实质脏器、脐带及脐带血中均提取到了与骨髓基质细胞生物学特性相似、免疫表型相同的干细胞，因此将间质组织来源的与骨髓MSCs生物学性状相似，具有多向分化潜能的细胞统称为间质干细胞。MSCs是多潜能的成体基质细胞，能分化为多种间质起源的组织，如成骨、软骨和脂肪细胞，在特殊环境下，还能横向分化为肌细胞、神经细胞、血管内皮细胞、肝胰细胞等多种其他组织细胞。MSCs分裂40代后仍能维持转染基因的表达，是基因治疗的优良载体。已有大量动物试验表明脐带MSCs移植治疗肝脏损伤、移植物抗宿主病、神经系统疾病、糖尿病、骨质缺损有效。但是人间质干细胞的获取量并不大，现有技术也未公开有脐带间充质干细胞针对皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的治疗技术。小鼠是常用的实验动物，一直以来分离小鼠间充质干细胞是开展干细胞诱导分化、干细胞治疗实验、干细胞模型研究的前提条件，是拓展小鼠作为实验动物在医学研究中广泛应用的有效手段。另一方面，小鼠作为动物模型的常用对象，在建立各种试验模型时，自身病理变化过程或致病因素在一定条件下作用，使其组织、器官或全身出现一些非预期的病理损伤(如烧烫伤)，而这种非预期的病理损伤极大的影响了原模型试验的准确性，例如非预期的皮肤烫伤导致小鼠血脑屏障功能的损坏会影响预期的其他因素对血脑屏障破坏的试验研究；因此，如何对小鼠血脑屏障的非预期诱因——皮肤烫伤进行排除具有重大意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种小鼠脐带间充质干细胞在保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的应用。小鼠脐带间充质干细胞在制备保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物中的应用。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案的所述小鼠脐带间充质干细胞采用以下方法制备：(1)获取胎鼠的脐带；(2)将胎鼠的脐带放入培养皿中，剪碎，并倒入1-2mlI型胶原酶，放入38摄氏度孵箱中孵育2小时；(3)取出培养皿，将其内容物吸取到15ml离心管中，加入1-2mlDMEM培养基，放入离心机中离心；(4)取出离心管，吸除上清，加入1mlDMEM培养基，将沉淀吹打均匀，吸出加入含有10mlDMEM培养基的培养皿中，并放入37摄氏度孵箱中孵育24小时为P1；(5)24小时后，取出培养皿并换液，待细胞长到80％进行传代，直到传到直到传到PN，即可；其中，PN为P2、P3、P4、P5或P6。本专利技术所述间充质干细胞在进一步的方案中PN以P3-P4最为适宜。本专利技术另一方面还公开了一种保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物的制备方法，包括下述步骤：1)将P3代小鼠细胞使用细胞计数器计数，约为5-6*106/ml；2)2mlPBS清洗2遍，加入1ml胰酶，放入37氏度孵箱中孵育2分钟；3)显微镜下观察细胞全部悬浮后，加入3mlDMEM混匀后，吸入15ml离心管中；4)放入离心机中离心；5)取出离心管，去除上清，加入500ul生理盐水，混匀，即得保护保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的注射剂。本专利技术公开了小鼠脐带间充质干细胞在保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物应用的方法，包括下述步骤：建立小鼠皮肤烫伤模型；在小鼠烫伤后0-1小时内，注入50-200ul混有小鼠脐带间充质干细胞的生理盐水。本专利技术另一方面对药物的施用时间进行限定，药物施用时间以小鼠烧伤后0-1小时为宜，以小鼠烧伤后1小时最佳。本专利技术提出小鼠脐带间充质干细胞在制备保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物中的应用。实验证明可以有效改善小鼠烫伤后血脑屏障通透性的改变，采用小鼠脐带间充质干细胞制备得到的保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物帮助患者减少药物治疗的种类和数量以及药物带来的各种副作用；而小鼠脐带来源的间质干细胞培养技术可控，并安全性好，治疗费用的接受程度好。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简要介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可根据这些附图获得其他的附图。图1为10kDa荧光示踪剂测定对照组烧伤后不同时间BBB的通透性改变；图2、图3为10kDa荧光示踪剂测定试验组烧伤后不同时间BBB的通透性改变。具体实施方式为了使本申请的目的、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。实施例1小鼠脐带间质干细胞体外分离、培养干细胞的来源为通过胎鼠来源细胞经体外扩增培养而成(1)获取胎鼠的脐带；(1.1)处死孕龄19-20天的C57孕鼠，将其浸泡酒精消毒；(1.2)剪开小鼠腹部，暴露腹腔，分离胎鼠放置在无菌的培养皿或操作盘中；(1.3)剪开胎膜暴露胎鼠及胎盘，暴露脐带，并用8cm止血钳固定脐带两端，在其外侧剪断脐带，并将分离后的脐带放入无菌培养皿中，重复上述步骤直到全部胎鼠脐带被分离；(2)将胎鼠的脐带放入培养皿中，剪碎，并倒入1-2mlI型胶原酶，放入37摄氏度孵箱中孵育2小时；(3)取出培养皿，将其内容物吸取到15ml离心管中，加入1-2mlDMEM培养基，放入离心机中离心，离心转速为1000rpm，时间为5min；(4)取出离心管，吸除上清，加入1mlDMEM培养基，将沉淀吹打均匀，吸出加入含有10mlDMEM培养基的培养皿中，并放入37摄氏度孵箱中孵育24小时为P1；(5)24小时后，取出培养皿并换液，待细胞长到80％进行传代，直到传到PN，即可；其中，PN为P2、P3、P4、P5或P6。上述步骤中的所述DMEM培养基含有10％胎牛血清及1％青链霉素。上述步骤中的间充质干细胞的传代PN在一些示例中选用P3-P4。在上述方法制备的小鼠脐带细胞还可通过下述方法进行冻存、复苏。(6)小鼠脐带细胞冻存消化贴壁细胞，加入0.1ml二甲基亚砜(DMSO)，0.9ml胎牛血清，移入细胞冻存管；冻存细胞(4℃，1小时；-20℃，4小时；-70℃，12小时；液氮罐保存)。(7)小鼠脐带细胞复苏取出冻存管，立即放入37℃水浴中，摇动，迅速解冻；吸管吸出细胞悬液，放入离心管，加入10mlPBS，吹打；离心(常温，5min)，弃上清，重复一次；加入L-DMEM完全培养液接种于培养瓶中。对获取的小鼠脐带细胞进行鉴定。(8)小鼠脐带细胞的鉴定(8.1)细胞总数本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.小鼠脐带间充质干细胞在制备保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.小鼠脐带间充质干细胞在制备保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物中的应用。


2.根据权利要求1所述小鼠脐带间充质干细胞在制备保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物中的应用，其特征在于，所述小鼠脐带间充质干细胞采用以下方法制备：
(1)获取胎鼠的脐带；
(2)将胎鼠的脐带放入培养皿中，剪碎，并倒入1-2mlI型胶原酶，放入38摄氏度孵箱中孵育2小时；
(3)取出培养皿，将其内容物吸取到15ml离心管中，加入1-2mlDMEM培养基，放入离心机中离心；
(4)取出离心管，吸除上清，加入1mlDMEM培养基，将沉淀吹打均匀，吸出加入含有10mlDMEM培养基的培养皿中，并放入37摄氏度孵箱中孵育24小时为P1；
(5)24小时后，取出培养皿并换液，待细胞长到80％进行传代，直到传到PN，即可；其中，PN为P2、P3、P4、P5或P6。


3.根据权利要求2所述小鼠脐带间充质干细胞在制备保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物中的应用，其特征在于，所述步骤(1)具体步骤为：
(1.1)处死孕龄19-20天的C57孕鼠，将其浸泡酒精消毒；
(1.2)剪开小鼠腹部，暴露腹腔，分离胎鼠放置在无菌的培养皿或操作盘中；
(1.3)剪开胎膜暴露胎鼠及胎盘，暴露脐带，并用8cm止血钳固定脐带两端，在其外侧剪断脐带，并将分离后的脐带放入无菌培养皿中，重复上述步骤直到全部胎鼠脐带被分离。


4.根据权利要求2所述小鼠脐带间充质干细胞在制备保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物中的应用，其特征在于，所述步骤(3)中的离心转速为1000rpm，时间为5min；所述DMEM培养基含有10％胎牛血清及1％青链霉素。

【专利技术属性】
技术研发人员：杨思明，杨劼，刘煜凡，马奎，付小兵，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：北京;11