一种降低GVHD发病率的移植物制造技术

本发明专利技术实施例公开了一种降低GVHD发病率的移植物，其特征在于，所述移植物通过将胎盘亚全能干细胞和脐带血造血干细胞混合培养得到；本发明专利技术通过将胎盘亚全能干细胞和脐带血造血干细胞共同培养制备得到移植物，通过将该移植物进行回输，能够有效降低CVHD的发变绿和发病程度。

A graft to reduce the incidence rate of GVHD

【技术实现步骤摘要】
一种降低GVHD发病率的移植物
本专利技术实施例涉及造血干细胞移植
，具体涉及一种降低GVHD发病率的移植物。
技术介绍
移植物抗宿主疾病(GVHD)是骨髓移植后出现的多系统损害(皮肤、食管、胃肠，肝脏等)的全身性疾病，是造成死亡的重要原因之一。由于供受体之间存在着免疫遗传学差异，移植骨髓中的免疫活性细胞(主要是T淋巴细胞)识别了受体的不同组织相容性抗原而增生分化，在受体内增生到一定程度后把受体的某些组织或器官作为靶目标进行免疫攻击产生损害。将同种反应性T淋巴细胞移植至免疫功能不健全的患者体内时，可能发生的一种潜在的可致死性临床并发症。供体T细胞一经被输注至受体体内，就会识别宿主细胞抗原，导致影响肝脏、胃肠道和皮肤的免疫级联反应。目前，GVHD的治疗和预防方法包括移植后进行常规免疫抑制、低强度预处理及在输注前耗竭或抑制同种反应性供体的T淋巴细胞。不过，这些方法的临床效果受多种副作用的限制。例如，常规免疫抑制与增加再次感染病毒及机会性病毒感染的风险有关联，而低强度预处理方案则与复发率增加有关联。目前，耗竭或抑制供体T淋巴细胞是最具前景的GVHD预防性治疗方法。通过淋巴细胞毒性剂、专用的T淋巴抑制剂及专门针对C0.9％NaCl生理盐水34+造血干细胞和祖细胞(HSPC)选择的T细胞耗竭剂等多种方法，可实现该目的。尽管人们已经证实，这些方法可有效地降低GVHD发病率，但是，它们会降低受体重构免疫系统的速度，增加患者出现致命感染的危险并可能具有限制移植物抗白血病的效果；此外，现有技术直接将造血干细胞移植，临床GVHD发病率较高。
技术实现思路
为此，本专利技术实施例提供一种降低GVHD发病率的移植物，以解决现有技术中GVHD发病率较高的问题。为了实现上述目的，本专利技术实施例提供如下技术方案：根据本专利技术实施例的第一方面提供一种降低GVHD发病率的移植物，所述移植物通过将胎盘亚全能干细胞和脐带血造血干细胞混合培养得到。本专利技术通过将胎盘亚全能干细胞和脐带血造血干细胞共同培养制备得到移植物，通过将该移植物进行回输，能够有效降低CVHD的发变绿和发病程度。进一步地，所述胎盘亚全能干细胞和脐带血造血干细胞的数量比为(4-6)∶1。进一步地，所述培养具体为：将胎盘亚全能干细胞和脐带血造血干细胞的混合细胞按照2×106cell/瓶进行接种，每个培养瓶中的培养体系为15mLDMEMF12+10ng/mlEGF+10ng/mlbFGF液，然后盖盖，再将培养瓶置5％CO2、饱和湿度、37℃培养箱中培养。进一步地，所述胎盘亚全能干细胞通过如下方法制得：(a)选取胎盘羊膜并进行预处理；(b)将清洗后的羊膜进行消化处理、过滤、离心、接种；(c)对接种后的细胞进行培养扩增，即得所述胎盘亚全能干细胞。进一步地，所述预处理为将羊膜置于含50mL0.9％NaCl生理盐水液的无菌小烧杯内，用镊子反复涮洗后取出放入新的无菌烧杯中加入0.9％NaCl生理盐水液再次涮洗，如此用0.9％NaCl生理盐水清洗3次以上，去除溶血，再用镊子将羊膜取出放置在肾形盘上，去除黏膜和溶血组织，将羊膜分成3-4cm大小方块；再将处理后的羊膜移至含50mL0.9％NaCl生理盐水液的新的无菌烧杯内，反复涮洗后放入新的烧杯中加入0.9％NaCl生理盐水液再次涮洗，如此反复冲洗16次以上。进一步地，所述消化处理包括如下步骤：(1)清洗后羊膜置于无菌消化瓶中，加入同体积的0.25％胰蛋白酶液混匀，37℃培养箱中静止消化5-10min；(2)待消化结束后，向消化瓶中加入0.9％NaCl生理盐水拧紧瓶盖，轻轻摇匀，再将消化瓶内的混合物倒入100mL烧杯中，用镊子夹住羊膜反复涮洗后移入新的烧杯中并加入50mL0.9％NaCl生理盐水再次涮洗，反复涮洗2-3次；(3)将清洗后的羊膜移入消化瓶中并加入同体积的0.25％胰蛋白酶液混匀，37℃培养箱中静置消化15-20min。进一步地，所述过滤为待消化结束后，加入0.9％NaCl生理盐水液充分摇匀，将消化羊膜组织液倒入100mL烧杯中，用镊子将羊膜取出，放入消化瓶中反复上述操作2-3次，然后用镊子将羊膜舍弃，将获得消化产物的溶液经200目滤网过滤至加有20mL0.25％胰蛋白酶液的200mL蓝盖瓶中，摇匀，再分装到4个50mL离心管中。进一步地，所述离心为将滤液在2000rpm离心15min。进一步地，所述接种为按照(4-5)×106cell/T75培养瓶进行接种，其中，T75培养瓶中的培养体系为15mLDMEMF12+10ng/mlEGF+10ng/mlbFGF液。进一步地，所述培养扩增包括如下步骤：(1)将接种后的细胞在5％CO2、饱和湿度、37℃条件下进行培养，培养5-7天后全量换液，随后每3-5天半量换液，待细胞80％融合时，采用0.25％胰蛋白酶消化，按照1∶3传代；(2)按照1:3的传代比例后，接种至T75培养瓶中，且培养体系为15mLDMEMF12+10ng/mlEGF+10ng/mlbFGF液，待细胞生长80％融合度时，弃去上层培养液，吸取15mL0.9％NaCl生理盐水轻轻加入培养瓶内，弃去洗液；(3)再将0.25％胰蛋白酶液1.5mL加入到培养瓶内，迅速盖盖，轻轻拍打或左右摇晃，当80％细胞呈单个时，迅速加入0.5-1mLFCS终止胰蛋白酶作用；(4)向终止后的培养瓶中添加10mL0.9％NaCl生理盐水，用PEP枪反复吹打，使细胞完全变成单个时移入到50mL离心管中，充分混匀，用微量加样枪吸取25μL细胞悬液，用做细胞计数，随后离心管盖盖，封口膜封口，以1000rpm离心5min；(5)离心结束，弃上清液，根据计数结果，按照2×106cell/培养瓶重新接种至新的培瓶内，其中，培养瓶中的培养体系为15mLDMEMF12+10ng/mlEGF+10ng/mlbFGF液；(6)将培养瓶置于5％CO2，饱和湿度，37℃条件下进行培养；(7)传代至P3代，按1×104个/ml接种到24孔板内，并加入DMEMF12+10ng/mlEGF+10ng/mlbFGF液进行培养，得到P4代胎盘亚全能干细胞。进一步地，所述脐带血造血干细胞通过如下方法制得：1)采集脐带血，并向脐带血中添加脐带血重量20％的HESPAN；2)将添加HESPAN的脐带血进行混匀、离心，去除脐带血中的红细胞；3)将去除红细胞的脐带血再次进行离心、抽取血浆，即得所述脐带血造血干细胞。进一步地，所述步骤2)中，离心条件为10℃、50g、离心7min。进一步地，所述步骤3)中，离心条件为10℃、747g、离心15min。本专利技术实施例具有如下优点：本专利技术通过将胎盘亚全能干细胞和脐带血造血干细胞共同培养制备得到移植物，通过将该移植物进行回输，能够有效降低CVHD的发变绿和发病程度。附图说明为了更清楚地说明本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种降低GVHD发病率的移植物，其特征在于，所述移植物通过将胎盘亚全能干细胞和脐带血造血干细胞混合培养得到。/n

【技术特征摘要】
1.一种降低GVHD发病率的移植物，其特征在于，所述移植物通过将胎盘亚全能干细胞和脐带血造血干细胞混合培养得到。


2.根据权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述胎盘亚全能干细胞和脐带血造血干细胞的数量比为(4-6)∶1。


3.根据权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述培养具体为：
将胎盘亚全能干细胞和脐带血造血干细胞的混合细胞按照2×106cell/瓶进行接种，每个培养瓶中的培养体系为15mLDMEMF12+10ng/mlEGF+10ng/mlbFGF液，然后盖盖，再将培养瓶置5％CO2、饱和湿度、37℃培养箱中培养。


4.根据权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述胎盘亚全能干细胞通过如下方法制得：
(a)选取胎盘羊膜并进行预处理；
(b)将清洗后的羊膜进行消化处理、过滤、离心、接种；
(c)对接种后的细胞进行培养扩增，即得所述胎盘亚全能干细胞。


5.根据权利要求4所述的移植物，其特征在于，所述消化处理包括如下步骤：
(1)清洗后羊膜置于无菌消化瓶中，加入同体积的0.25％胰蛋白酶液混匀，37℃培养箱中静止消化5-10min；
(2)待消化结束后，向消化瓶中加入0.9％NaCl生理盐水拧紧瓶盖，轻轻摇匀，再将消化瓶内的混合物倒入100mL烧杯中，用镊子夹住羊膜反复涮洗后移入新的烧杯中并加入50mL0.9％NaCl生理盐水再次涮洗，反复涮洗2-3次；
(3)将清洗后的羊膜移入消化瓶中并加入同体积的0.25％胰蛋白酶液混匀，37℃培养箱中静置消化15-20min。


6.根据权利要求4所述的移植物，其特征在于，所述接种为按照(4-5)×106cell/T75培养瓶进行接种，其中，T75培养瓶中的培养体系为15mLDMEMF12+10ng/mlEGF+10ng/mlbFGF液。


7.根据权利要求4所述的移植物，其特征在于，所述培养扩增包括如下步骤：
(1)将接种后的细胞在5％CO2、饱和湿度...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴勇君，江良旗，王俊，
申请(专利权)人：中冠赛尔生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11