一种用于辅助贫血治疗的复合物及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于辅助贫血治疗的复合物及其制备方法，所述复合物由红系祖细胞和MSC的外泌体组成。与传统的直接输注红细胞相比，红系祖细胞在体内的分化更完全，使用方便，不会占用日益紧张的成分血资源，减轻社会的医疗负担；使用MSC的外泌体作为MSC部分功能的替代，可把MSC用于其他重症疾病的治疗，不但兼顾了成本，也更全面的利用生物资源，简便安全和高效；红系祖细胞与MSC外泌体的配合对贫血辅助治疗提供了长效的红细胞来源，对于贫血辅助治疗具有较好的效果。另外，对于很多非病理性贫血人群，可避免直接输注红细胞导致过度医疗，更避免了由反复直接输注红细胞引起的去铁治疗等，节省患者的花费，具有重要的医用前景。

A compound for adjuvant anemia treatment and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
一种用于辅助贫血治疗的复合物及其制备方法
本专利技术属于细胞
，涉及一种用于辅助贫血治疗的复合物及其制备方法。
技术介绍
贫血(anemia)是身体不良状态或疾病而导致的症状，主要表现为：外周血的红细胞容量低于正常值的临床综合征，是指在一定容积的循环血液内红细胞计数血红蛋白量以及红细胞压积均低于人群的正常标准。红细胞是把氧运输到全身各组织器官的血液细胞，贫血使氧携带运输作用受到直接影响，从而使组织器官产生缺氧的一系列表现，如常见的皮肤粘膜苍白等，是轻症贫血的典型表现；当脑细胞缺氧时，轻者感头昏，注意力不集中，记忆力差；重者可出现嗜睡或昏迷。为了代偿贫血时机体组织器官供氧量的不足，导致心脏增加跳动次数及搏出量，可引起心慌、胸闷、气短，因此长期的贫血会使心脏负荷加重，心脏肥厚扩大，可致淤血及心力衰竭。根据WHO的统计，全球约有30亿人患有不同程度的贫血，每年因患贫血引致各类疾病而死亡的人数上千万。而中国的贫血人口概率高于西方国家，因此更需要更多有效的贫血辅助治疗方式。目前，对于严重的贫血性疾病的临床治疗，如地中海贫血，再生障碍性贫血等，需要定期输注红细胞或者进行造血干细胞移植。地中海贫血的患者，由于要定期输注大量红细胞，不但对成分血需求巨大，而且还需要定期进行去铁治疗，对患者本身有着重大的经济负担和精神压力。而对于轻症的贫血症状，更是一直缺乏有效的治疗方法，因此轻症贫血患者日常工作和生活均受到长期的负面影响。造血干细胞具有构建人体造血的功能，可以自我更新并分化为各类血细胞的前体细胞，最终分化成血小板、红细胞和白细胞等成体血液细胞。在红细胞方向，造血干细胞可分化为红系祖细胞(Erythroidprogentitorcell,EryPC)，然后进一步分化为成熟的红细胞，实现机体的氧气运输功能。随着科研的不断深入，2010年，Arvind等证实，造血干细胞在体外定向诱导分化为红系祖细胞后输注回机体，红系祖细胞可与骨髓基质细胞有效地相互作用，提高了红系祖细胞在体内的存活率和增加了后期成熟比例，也就是说红系祖细胞的分化在体内比在体外培养更完全，因此输注红系祖细胞并在体内的成熟过程可视为一种新的治疗方法，能更有效的缓解了临床输血的需求和减轻患者的精神压力，尤其对于轻症贫血，有积极的临床意义。外泌体(exosome)在近年的研究中陆续发现其临床治疗的重要价值。外泌体最早的研究报道是1983年，在绵羊网织红细胞中发现了含有RNA和蛋白质成分的小膜泡(30-150nm)结构，1987年Johnstone将其命名为外泌体。目前，在世界各国科学家的广泛研究得出的结论，由于外泌体蕴含了来源细胞的RNA和蛋白质，可部分行使其来源细胞的功能和作用。MSC(Mesenchymalstemcell，间充质干细胞)是来自于中胚层的干细胞，在2000年后开始广泛用于临床试验，用于辅助造血植入，治疗糖尿病等代谢性疾病等。在MSC扩增培养，收集细胞用于临床，而细胞培养基中含有大量的外泌体，富集提取后可以实现MSC的部分效果。因此MSC在扩增培养过程中所产生的外泌体，可以通过一系列操作收集，并与红系祖细胞组合，构成辅助贫血治疗的复合细胞成分制剂，该制剂为长效制剂。由于该复合细胞成分制剂是活性制剂，可以在机体内更长的时间范围内发挥效能，红系祖细胞逐渐分化成熟为红细胞，同时MSC的外泌体可以辅助造血，从而更有效地对贫血性疾病提供辅助治疗。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的是提供一种辅助贫血治疗的长效复合细胞成分制剂的方法，该方法制备过程简单、可靠且重复性好，污染可能性低，兼顾了制备成本的经济性和操作安全性，为临床应用提供了更可靠的支持。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种用于辅助贫血治疗的复合物，所述复合物由红系祖细胞和MSC外泌体组成。造血干细胞可分化为巨核祖细胞、红系祖细胞(EryPC)等，而红系祖细胞为活性细胞，在机体内分化为红细胞的分化完全程度比在体外分化更好，因此对贫血性疾病而言，输注红系祖细胞比直接输注红细胞具有更大的灵活性和可操作性。MSC的制备过程耗时长久且成本高，MSC在支持移植后的造血植入，在治疗代谢性疾病以及运动系统疾病方面具有明确的医疗价值，是重要细胞资源。MSC的外泌体含有的RNA和蛋白质，可部分行使MSC的医学功能，可以辅助红系祖细胞在体内的分化。作为本专利技术的优选实施方式，所述复合物中，所述红系祖细胞与所述MSC外泌体的比例为4*105个：0.36～0.72μg。培养4*105个MSC的所收集的培养基分离获得的外泌体为0.36～0.72μg。作为本专利技术的优选实施方式，所述红系祖细胞由脐带血造血干细胞定向分化培养制得。作为本专利技术的优选实施方式，所述红系祖细胞的制备包含如下步骤：将脐带血造血干细胞接种于红系祖细胞诱导培养基，连续培养21天，在第7天和第14天加入50％原始体积的红系祖细胞诱导培养基。作为本专利技术的优选实施方式，所述的红系祖细胞诱导分化培养过程中使用的培养基为含有白皮杉醇、人白细胞介素-3(IL-3)、人干细胞生长因子(SCF)、促红细胞生成素(EPO)和地塞米松(DEX)的造血干细胞培养基。更优选地，所述的红系祖细胞诱导培养基中，白皮杉醇、人白细胞介素-3、人干细胞生长因子、促红细胞生成素和地塞米松的终浓度分别为5μmol/L、20ng/mL、100ng/mL、1.5U/mL和1nM。作为本专利技术的优选实施方式，所述MSC外泌体由脐带组织制备的MSC分泌得到。作为本专利技术的优选实施方式，所述MSC外泌体制备方法为：(1)处理脐带组织得到原代细胞，通过Fasgrow培养基培养制得原代MSC；(2)扩增培养所述原代MSC至第四代，通过超高速离心即可收集得到培养基中的MSC外泌体。所述Fasgrow培养基购于杭州百通公司。一般地，脐带在采集后24小时内进行组织原代处理，在T25培养瓶中加入Fasgrow培养基，放入37℃、5％CO2培养箱培养12天左右，直至每个T25培养瓶有3～4个500个细胞左右的集落，即获得原代(P0代)MSC。传代时，按1:6的比例传代到T75培养瓶中，连续培养四天后获得P1代MSC，后面可按1:8的比例再传代。当传代次数过多时，细胞干性消失，因此选择传代至第P4代收集培养基中外泌体。本专利技术还要求保护用于辅助贫血治疗的药物组合物，所述组合物包括所述的复合物。作为本专利技术的优选实施方式，所述药物组合物还包括药学上可接收的辅料或载体。本专利技术提供了一种由红系祖细胞和MSC外泌体形成的复合物，红系祖细胞与MSC外泌体的配合，为贫血辅助治疗提供了长效的红细胞来源，对于贫血辅助治疗具有较好的效果。此外，本专利技术相对于现有技术具有如下的优点：1)本专利技术使用了具有细胞活性的红系祖细胞，对于传统的红细胞输注而言，红系祖细胞在体内的分化更完全，使用方便，而且不会占用日益紧张的成分血资源；2)本专利技术使用MSC的外泌体，在MSC的制备完成后，对MSC培养基通过超高本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于辅助贫血治疗的复合物，其特征在于，所述复合物由红系祖细胞和MSC外泌体组成。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于辅助贫血治疗的复合物，其特征在于，所述复合物由红系祖细胞和MSC外泌体组成。


2.如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述复合物中，所述红系祖细胞与所述MSC外泌体的比例为4*105个：0.36～0.72μg。


3.如权利要求1所述复合物，其特征在于，所述红系祖细胞由脐带血造血干细胞定向分化培养制得。


4.如权利要求3所述所述复合物，其特征在于，所述红系祖细胞的制备包含如下步骤：将脐带血造血干细胞接种于红系祖细胞诱导培养基，连续培养21天，在第7天和第14天加入50％原始体积的红系祖细胞诱导培养基。


5.如权利要求4所述所述复合物，其特征在于，所述的红系祖细胞诱导分化培养过程中使用的红系祖细胞诱导培养基为含有白皮杉醇、人白细胞介素-3、人干细胞生长因子、促红细胞生成素和地塞米松的造血干细胞培养基。

<...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏伟，嵐山芮，袁嘉恩，
申请(专利权)人：广州市天河诺亚生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44