一种肿瘤微环境中性粒细胞胞外诱捕网调控的智能药物递送系统及其制备方法技术方案

本发明专利技术公开了一种肿瘤微环境中性粒细胞胞外诱捕网调控的智能药物递送系统及其制备方法。该智能递药系统是由胞内还原性谷胱甘肽响应的PTX前药纳米粒为核，可被金属基质蛋白酶剪切释放并串联穿膜肽的DNase Ⅰ接枝聚赖氨酸为壳，组成的“核‑壳”型DNase Ⅰ/PTX智能共递送载体。PTX前药纳米粒是利用前药分子PTX‑SS‑C

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤微环境中性粒细胞胞外诱捕网调控的智能药物递送系统及其制备方法
本专利技术属于肿瘤及其微环境靶向与缓释给药系统
，涉及一种肿瘤微环境中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)调控的智能药物递送系统，具体涉及一种新型脱氧核糖核酸酶联合紫杉醇纳米粒的恶性肿瘤智能靶向纳米递释系统及其制备方法。
技术介绍
随着科学水平和医疗技术的发展，非传染性疾病成为困扰人类健康的主要病种。其中，恶性肿瘤已在全球范围内成为仅次于心血管疾病的第二大致死病因。据世界卫生组织预测，2030年全球恶性肿瘤病人死亡人数将达到1200万，其中2/3将发生在中低收入国家。在我国，恶性肿瘤的发病率约为200/10万，每年新发病例在250万左右。恶性肿瘤给人类健康和生命造成极大威胁，给家庭及社会带来沉重的负担。因此，开发安全有效的抗肿瘤药物具有重大的社会意义和临床价值。肿瘤微环境是在肿瘤进展过程中，由肿瘤细胞，基质细胞(成纤维细胞、炎性细胞、免疫细胞、周细胞、血管内皮细胞等)，细胞外基质等共同组成的局部稳定环境，呈现出组织间液压升高与局部缺氧等病理性特征，为肿瘤的发生、发展、侵袭及转移等过程提供了必要的物质基础。一直以来，科学界对肿瘤靶向递药系统的研究，主要集中于肿瘤细胞靶向的开发。然而，由于肿瘤细胞的高度异质性，非常容易产生基因突变和表观遗传变化，导致耐药，临床获益非常有限。由于肿瘤微环境相对稳定，不容易耐药，引起了肿瘤靶向治疗研究者的高度关注。所以，靶向肿瘤细胞与调控肿瘤微环境相结合的治疗策略，成为肿瘤靶向研究领域新的热点。肿瘤微环境被认为是“永不愈合伤口”与持续炎症状态，肿瘤组织通过释放趋化因子、细胞因子、过氧化氢等信号分子，将外周血中的中性粒细胞招募到肿瘤部位。肿瘤相关的中性粒细胞在肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素8(IL-8)等细胞因子刺激下，形成NETs。NETs，即中性粒细胞胞外诱捕网(NeutrophilExtracellularTraps)是中性粒细胞受到外界刺激活化时释放到胞外的DNA骨架纤维网，同时包含组蛋白、髓过氧化物酶(MPO)、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、组织蛋白酶G(CG)、以及基质金属蛋白酶9(MMP-9)等颗粒蛋白。研究表明：NETs作为肿瘤微环境的重要组成部分，在促进肿瘤细胞增殖、远处转移以及血管生成和阻碍肿瘤治疗中发挥着关键作用。研究发现，脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)可以通过降解NETs抑制恶性肿瘤的增殖并阻止向远处器官的转移，可以用于恶性肿瘤的治疗。然而，提高DNaseI的体内循环寿命，增强其向肿瘤组织的渗透与滞留作用，是提高DNaseI体内治疗肿瘤效果的关键所在。紫杉醇(Paclitaxel，PTX)是一线广谱抗肿瘤药物，疗效显著，具有很强的微管稳定功能，在临床上已经广泛用于乳腺癌、卵巢癌、肺癌和部分头颈癌的治疗。所以，将DNaseI和PTX联合用药：DNaseⅠ可以高效降解肿瘤微环境NETs，从而抑制肿瘤细胞增殖，降低肿瘤转移和减少肿瘤血管新生，还可以疏通对肿瘤细胞的机械性屏障，促进PTX制剂向肿瘤内部的渗透；PTX直接作用于肿瘤细胞，通过稳定肿瘤细胞微管蛋白而杀死肿瘤细胞。二者相得益彰，同时靶向肿瘤的“土壤”和“种子”，发挥调控与重塑肿瘤微环境和直接杀死肿瘤细胞的协同治疗作用，最大限度提高肿瘤的治疗效果。要实现DNaseⅠ与PTX两种药物的联合使用，选择合适的共递送载体显得尤为重要。共递送载体是药物递送领域的重要研究方向，目前共递送技术主要是将多种药物一起担载于脂质体、胶束、纳米粒等药物载体中，利用纳米载体将共载药物递送至同一作用部位，增强多种药物联用的治疗效果。然而，由于DNaseⅠ的靶点为肿瘤微环境中的NETs，而PTX的靶点为肿瘤细胞内的微管，二者靶部位不同导致现有共递释载体无法递送这两种药物至各自靶点发挥药效。
技术实现思路
鉴于目前仅针对肿瘤细胞的单一制剂疗效不理想，易引起耐药等缺陷，提供一种既靶向肿瘤细胞又能调控肿瘤微环境NETs的联合治疗方法，提高恶性肿瘤的治疗效果。本专利技术的目的还在于，针对目前游离DNaseI和PTX在治疗恶性肿瘤时存在的缺陷，提供一种智能靶向纳米药物递送载体及其制备方法，延长药物体内的循环时间，增加药物在肿瘤部位的蓄积，提高抗肿瘤疗效，降低毒副作用，达到靶向联合治疗增效减毒目的。本专利技术的目的是，利用肿瘤微环境NETs中高表达MMP-9，以及肿瘤细胞内GSH浓度高的特殊条件，设计构建一种在肿瘤部位响应性治疗的智能载体。该智能载体能够能靶向至肿瘤微环境调控NETs，同时暴露的穿膜肽增加PTX前药纳米粒的细胞内吞作用，在肿瘤细胞内，以GSH为智能释药开关，响应病灶部位GSH介导的降解作用，使前药纳米粒在肿瘤细胞内发生裂解释放出PTX杀死肿瘤细胞，达到NETs降解与肿瘤细胞杀伤并策，联合提高恶性肿瘤的治疗效果。本专利技术的目的通过以下技术方案实现的：一种肿瘤微环境中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)调控的智能药物递送系统，是由对GSH响应的PTX前药纳米粒、PTX前药纳米粒表面接枝的聚赖氨酸、琥珀酰亚胺基羧甲基酯-聚乙二醇-叠氮(NHS-PEG3500-N3)、MMP-9酶底物肽段与细胞穿膜肽串联氨基酸序列、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)以及脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)组成；其中，所述的PTX前药纳米粒和前药纳米粒表面接枝的聚赖氨酸通过电荷吸附作用实现包裹融合。优选上述PTX前药纳米粒是利用二硫代甘醇酸将PTX与十八醇(C18-OH)化学键合，得到PTX前药分子PTX-SS-C18，前药分子自组装形成PTX前药纳米粒NP/PTX，并将NP/PTX表面涂层上阳离子聚赖氨酸，PTX-SS-C18与聚赖氨酸的质量比为1:1～5，聚赖氨酸的分子量为70000～150000。优选上述琥珀酰亚胺基羧甲基酯-聚乙二醇-叠氮(NHS-PEG3500-N3)中的聚乙二醇分子量为500-3500，MMP-9酶底物肽段与细胞穿膜肽串联后的氨基酸序列为GRKKRRQRRRPQPLGLAGGC，所述的DNaseⅠ是通过Sulfo-SMCC为连接分子化学接枝在串联的MMP-9酶底物肽段与细胞穿膜肽上。优选上述PTX-SS-C18与DNaseⅠ的质量比为1:0.5～3。具体的：本专利技术智能递药系统是由胞内还原性谷胱甘肽(GSH)响应的PTX前药纳米粒为核，可被金属基质蛋白酶(MMP-9)剪切释放并串联穿膜肽的DNaseⅠ接枝聚赖氨酸为壳，组成的“核-壳”型DNaseⅠ/PTX智能共递送载体。所述PTX前药纳米粒是利用二硫代甘醇酸将PTX与十八醇(C18-OH)化学键合，得到PTX前药分子PTX-SS-C18，前药分子自组装形成PTX前药纳米粒，对该纳米粒用聚赖氨酸进行包被；以MMP-9底物肽串联穿膜肽(GRKKRRQRRRPQPLGLAGGC)为连接分子，将DNaseⅠ蛋白接枝在包被于PTX前药纳米粒表面的聚赖氨酸氨基侧链上，构建一种肿瘤微环境中性粒细胞胞外诱捕网(N本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肿瘤微环境中性粒细胞胞外诱捕网调控的智能药物递送系统，其特征在于该纳米给药系统是由对GSH响应的PTX前药纳米粒、PTX前药纳米粒表面接枝的聚赖氨酸、琥珀酰亚胺基羧甲基酯-聚乙二醇-叠氮、MMP-9酶底物肽段与细胞穿膜肽串联氨基酸序列、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐以及脱氧核糖核酸酶Ⅰ组成。/n

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤微环境中性粒细胞胞外诱捕网调控的智能药物递送系统，其特征在于该纳米给药系统是由对GSH响应的PTX前药纳米粒、PTX前药纳米粒表面接枝的聚赖氨酸、琥珀酰亚胺基羧甲基酯-聚乙二醇-叠氮、MMP-9酶底物肽段与细胞穿膜肽串联氨基酸序列、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐以及脱氧核糖核酸酶Ⅰ组成。


2.根据权利要求1所述的中性粒细胞胞外诱捕网调控的智能药物递送系统，其特征是：所述PTX前药纳米粒是利用二硫代甘醇酸将PTX与十八醇化学键合，得到PTX前药分子PTX-SS-C18，前药分子自组装形成PTX前药纳米粒，并将PTX前药纳米粒表面涂层上阳离子聚赖氨酸，聚赖氨酸的分子量为70000～150000。


3.根据权利要求1所述的中性粒细胞胞外诱捕网调控的智能药物递送系统，其特征是：所述的琥珀酰亚胺基羧甲基酯-聚乙二醇-叠氮中的聚乙二醇分子量为500-3500、MMP-9酶底物肽段与细胞穿膜肽串联后的氨基酸序列为GRKKRRQRRRPQPLGLAGGC，所述的DNaseⅠ是通过Sulfo-SMCC为连接分子化学接枝在串联的MMP-9酶底物肽段与细胞穿膜肽上。


4.根据权利要求2所述的中性粒细胞胞外诱捕网调控的智能药物递送系统，其特征是：所述PTX-SS-C18与DNaseⅠ的质量比为1:0.15～3。


5.一种权利要求1所述的肿瘤微环境中性粒细胞胞外诱捕网调控的智能药物递送系统的制备方法，其特征是：将聚赖氨酸借助电荷吸附包被在PTX前药纳米粒表面，得到P-NP/PTX；利用Sulfo-SMCC为linker，将DNaseⅠ与N端炔基化的(Pro)GRKKRRQRRRPQPLGLAGGC肽进行接枝，得到多肽-蛋白偶联(Pro)GRKKRRQRRRPQPLGLAGGC-DNaseⅠ，再将该偶联物通过NHS-PEG3500-N3为linker，利用NHS端与P-NP/PTX表面游离氨基反应，另一端的叠氮基团与(Pro)GRKKRRQRRRPQPLGLAGGC-DNaseⅠ偶联物N端的炔基发生点击化学反应，将(Pro)GRKKRRQRRRPQPLGLAGGC-DNaseⅠ偶联物锚定在P-NP/PTX表面即组装成智能药物递送系统。


6.根据权利要求5所述的肿瘤微环境中性粒细胞胞外诱捕网调控的智能药物递送系统的制备方法，其特征在于PTX前药纳米粒是利用二硫代甘醇酸将PTX与十八醇化学键合，得到PTX前药分子PTX-SS-C18，前药分子自组装形成PTX前药纳米粒NP/PTX；其中，PTX-SS-C18制备方法包括以...

【专利技术属性】
技术研发人员：辛洪亮，尹昊媛，曹想，叶璐，陆红丹，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32