一种包含miR-204的外泌体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种装载有miR‑204的外泌体，其能够显著改善干眼症的症状和体征。通过将miR‑204在L929细胞中高表达，本发明专利技术获得了安全高产、来源稳定的装载miR‑204的外泌体，解决了MSC来源外泌体在实际应用上培养难、稳定性差等诸多限制，同时解决了脂质体转染转染效率不稳定、不同细胞间差异大、脂质体转染试剂毒性较大、作用时间较短、稳定性差的问题，推动了临床转化。

【技术实现步骤摘要】
一种包含miR-204的外泌体及其制备方法和应用
本专利技术属于生物医药和分子生物学
，具体涉及一种包含miR-204的外泌体及其制备方法和应用。
技术介绍
干眼（dryeye）又称角结膜干燥综合症(keratoconjunctivitissicca)，是指任何原因引起的泪液质或量的异常，或动力学异常导致泪膜稳定性下降，并伴有眼部不适和（或）眼表组织损害为特征的多种疾病的总称。干眼病因繁多，累及人群广泛，目前治疗效果有限，极大影响了患者的生活和工作，给社会带来沉重负担。外泌体（exosomes）是一类由细胞分泌的携带胞质组分的纳米级别的膜性小泡，其中含有蛋白质、mRNA和miRNA等多种生物活性物质，可通过膜融合的方式将miRNA等有效成分传递给其他细胞或调节其受体，作为细胞之间相互交流的桥梁。更重要的是，使用外泌体可以规避细胞治疗的致瘤性等潜在安全问题。近年发现，间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)外泌体（MSC-exo）在诸多疾病中的治疗作用和潜在临床价值，它能缓解炎症，调节免疫反应及促进组织再生，被认为是潜在的药物载体，有望成为间充质干细胞细胞疗法的替代。但目前存在的突出问题包括：MSC细胞获取困难；培养难度大；传代不稳定等，难以提供稳定的外泌体来源，制约了该成果迈向临床。脂质体转染是miRNA的重组表达质粒或合成的成熟miRNA序列进入细胞的常用技术手段。但是，利用脂质体转染其转染效率不稳定，不同细胞间存在差异，而且脂质体转染试剂毒性较大，作用时间较短，稳定性差。对此，人们又尝试用各种病毒载体将miRNA插入到细胞基因组以解决脂质体转染效率问题。然而，病毒载体对人类基因组的安全仍具有威胁，可能引起免疫反应、整合入基因组的隐患及病毒具有复活毒性的可能等所造成的系列安全问题一直饱受争议。与人工构建的纳米载体相比，外泌体不仅具有体积小、结构稳定、能保护其内容物不被降解等特点，而且因其来源于细胞本身，天然具有无细胞毒性、低免疫原性、高生物相容性等优点，是一种理想的基因递送载体。
技术实现思路
针对上述存在问题和不足，本专利技术将表达miR-204的质粒导入L929细胞中，实现了稳定高表达miR-204的外泌体富集，并且在动物实验上实现了与MSC-exo类似的干眼症治疗效果，从而有效突破了MSC-exo在临床应用上的诸多限制，解决了miRNA体内直接应用的不稳定性的问题。本专利技术是通过如下技术方案得以实现的：本专利技术第一方面提供了一种预防和/或治疗干眼症的外泌体，所述外泌体中装载有miR-204（其全称为mmu-miR-204-5p，GeneID：MIMAT0000237，miRNA成熟体序列(5'-3'):uucccuuugucauccuaugccu）。作为优选地，所述外泌体选自间充质干细胞外泌体（MSC-exo）、人工改造外泌体中的一种或多种。作为优选地，所述人工改造外泌体通过以下步骤制备得到：（1）将miR-204经由慢病毒转染入稳定传代的成纤维细胞内；（2）筛选高表达miR-204的细胞株；（3）分离得到稳定装载miR-204的外泌体。作为优选地，步骤（1）中所述成纤维细胞为L929细胞，即所述人工改造外泌体为装载miR-204的L929外泌体（L929-miR-204-exo）。本专利技术第二方面提供了一种预防和/或治疗干眼症的药物组合物，所述药物组合物包括装载有miR-204的外泌体。作为优选地，所述外泌体选自间充质干细胞外泌体（MSC-exo）、人工改造外泌体中的一种或多种。作为优选地，所述人工改造外泌体通过以下步骤制备得到：（1）将miR-204经由慢病毒转染入稳定传代的L929细胞内；（2）筛选高表达miR-204的细胞株；（3）分离得到稳定装载miR-204的外泌体。作为优选地，步骤（1）中所述成纤维细胞为L929细胞。本专利技术第三方面提供了miR-204在制备预防和/或治疗干眼症药物中的应用。本专利技术第四方面提供了装载有miR-204的外泌体在制备预防和/或治疗干眼症药物中的应用。作为优选地，所述外泌体选自间充质干细胞外泌体（MSC-exo）、人工改造外泌体中的一种或多种。作为优选地，所述人工改造外泌体通过以下步骤改造得到：（1）将miR-204经由慢病毒转染入稳定传代的成纤维细胞内；（2）筛选高表达miR-204的细胞株；（3）分离得到稳定装载miR-204的外泌体。作为优选地，步骤（1）中所述成纤维细胞为L929细胞。作为优选地，所述预防和/或治疗干眼症的机制为：通过miR-204下调角膜巨噬细胞表面IL-6R的表达、抑制STAT3通路激活、促炎型表型巨噬细胞减少、抑炎型表型增多、各种炎症因子表达减少，从而预防和/或治疗干眼症。作为优选地，所述预防和/或治疗是指能够减轻、抑制、改善或缓解以下任意一种或多种症状、体征：（1）眼干涩感、异物感、灼烧感、畏光、视物模糊和视觉疲劳等眼不适感；（2）泪河变窄或中断，睑裂区角膜上皮点状脱落，角膜上皮缺损区荧光素着染；（3）角膜缘上皮细胞功能障碍、角膜变薄、溃疡甚至穿孔。本专利技术相对于现有技术具有如下有益效果：（1）本专利技术发现了MSC来源的外泌体在改善干眼症状方面的突出效用，并进一步发现MSC-exo中的miR-204是其主要作用成分。鉴于MSC-exo在临床应用上的诸多限制，本专利技术利用慢病毒构建了稳定高表达miR-204的L929细胞，收集富含miR-204的外泌体，并在干眼症动物模型中实现了与MSC-exo类似的治疗效果。（2）本专利技术提供的包载miR-204的外泌体，能够显著改善干眼症的症状和体征。通过将miR-204在L929细胞中高表达，本专利技术获得了安全高产、来源稳定的装载miR-204的外泌体，解决了MSC来源外泌体在实际应用上培养难、稳定性差等诸多限制，同时解决了脂质体转染转染效率不稳定、不同细胞间差异大、脂质体转染试剂毒性较大、作用时间较短、稳定性差的问题，推动了临床转化。附图说明图1为用mmu-miR-204precursor转染L929细胞及转染效率图。图2为高表达miR-204的L929外泌体与其他外泌体治疗后，泪液分泌量及荧光素钠染色评分的统计图。图3为成纤维细胞外泌体和MSC外泌体干预的苯扎氯铵模型后角膜组织中miR-204的水平。图4为MSC与L929细胞中miR-204水平。图5为高表达miR-204的L929外泌体与其他外泌体治疗效果对比的眼前段照相白光及荧光素钠染色钴蓝光图图6为高表达miR-204的L929外泌体治疗后，角膜染色显示巨噬细胞分型结果图。图7为qPCR结果图反应高表达miR-204的L929外泌体治疗后，炎症因子的表达水平。具体实施方式为使本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种预防和/或治疗干眼症的外泌体，所述外泌体中装载有miR-204。/n

【技术特征摘要】
1.一种预防和/或治疗干眼症的外泌体，所述外泌体中装载有miR-204。


2.根据权利要求1所述的预防和/或治疗干眼症的外泌体，其特征在于，所述外泌体选自间充质干细胞外泌体、人工改造外泌体中的一种或多种。


3.根据权利要求2所述的预防和/或治疗干眼症的外泌体，其特征在于，所述人工改造外泌体通过以下步骤制备得到：
（1）将miR-204经由慢病毒转染入稳定传代的成纤维细胞内；
（2）筛选高表达miR-204的细胞株；
（3）分离得到稳定装载miR-204的外泌体。


4.根据权利要求3所述的预防和/或治疗干眼症的外泌体，其特征在于，步骤（1）中所述成纤维细胞为L929细胞。


5.一种预防和/或治疗干眼症的药物组合物，所述药物组合物包括装载有根据权利要求1-4任一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳夏林，何嫦，周恬，
申请(专利权)人：中山大学中山眼科中心，
类型：发明
国别省市：广东;44