一种从脂肪组织中高效分离提取脂肪间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术涉及干细胞技术领域，尤其涉及一种从脂肪组织中高效分离提取脂肪间充质干细胞的方法。本发明专利技术公开的分离提取方法采用低浓度0.01%I型胶原酶溶液来消化脂肪组织，降低分离成本的同时降低I型胶原酶对细胞的伤害，提高细胞活率；另外，脂肪组织中加入无血清培养基后再进行消化，可在消化过程中维持细胞的生长繁殖，提高间充质干细胞的提取率。由于在I型胶原酶消化过程中无血清培养基的加入，使得未完全消化掉的脂肪组织中的细胞还保持着较好的活性，因此，本申请对未完全消化掉的脂肪组织继续培养至细胞汇合度为80%~90%时，再使用胰蛋白酶进行消化，获取间充质干细胞。本发明专利技术脂肪组织经两次消化提取的间充质干细胞得率高，且活率高。

【技术实现步骤摘要】
一种从脂肪组织中高效分离提取脂肪间充质干细胞的方法
本专利技术涉及干细胞
，尤其涉及一种从脂肪组织中高效分离提取脂肪间充质干细胞的方法。
技术介绍
间充质干细胞（MesenchymalStemCells，MSCs）最初从骨髓中提取，是一类具有无限自我复制更新能力的细胞，可在特定的条件下分化出超过一种以上的人体细胞类型，并能够在生物体内重建原来组织的功能。在2001年Zuk等人在人脂肪组织中成功分离获得间充质干细胞，并命名为人脂肪间充质干细胞（humanadiposederivedstem/stomalcells，hADSCs）。随后研究证明在脂肪组织中含有大量未分化的干细胞，且储量丰富。相对于骨髓MSCs，脂肪来源的MSCs，取材于抽脂术或外科手术中弃去的皮下脂肪，可使患者免受抽骨髓取材的痛苦。且人脂肪间充质干细胞在不同的条件下被成功诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、肝脏细胞等中胚层细胞，同时也可以向其他胚层分化，证明脂肪间充质干细胞是多分化潜能干细胞。近年来研究显示，MSCs具有调节免疫应答的能力，可在适应性免疫应答中抑制Ｔ细胞功能，改变辅助性Ｔ细胞（Th细胞）的平衡，诱导调节性Ｔ细胞（Treg）产生。Najar等研究指出hADSCs相比骨髓MSCs具有更强的免疫调节作用，被视为治疗自身免疫疾病如多发性硬化、移植物抗宿主病等比较理想的种子细胞。同时，hDASCs可通过自分泌或旁分泌途径释放细胞因子，这些活性物质可定向聚集于特定部位起到抑制细胞凋亡、纤维化，促进血管生成或缓解炎性反应等作用。hADSCs具有来源丰富、取材方便、免疫原性低、体外扩增容易等诸多优点，其在组织工程、创面修复及基因治疗方面具有良好的应用前景。因此，成功分离出hADSCs，实现其在体外扩增，是进一步探究其生物学作用和进行移植研究的基础。分离脂肪组织的过程中必须去除大体可见的血管与结缔组织，这样可以减少分离得到的细胞中内皮细胞及成纤维细胞的污染。目前，常用的hADSCs的分离方法是使用浓度为0.1%Ⅰ型胶原酶消化脂肪组织，该方法胶原酶浓度高，用量大，不利于大量获取细胞，难以满足干细胞研究的需求。同时Ⅰ型胶原酶价格昂贵，分离成本高，且较高的浓度易对细胞产生不可逆的损伤，影响研究结果。
技术实现思路
本专利技术提供了一种从脂肪组织中高效分离提取脂肪间充质干细胞的方法，解决了目前脂肪间充质干细胞的分离方法是使用浓度为0.1%Ⅰ型胶原酶消化脂肪组织，该方法胶原酶浓度高，用量大，不利于大量获取细胞，且Ⅰ型胶原酶价格昂贵，分离成本高的问题。其具体技术方案如下：本专利技术提供了一种从脂肪组织中高效分离提取脂肪间充质干细胞的方法，包括以下步骤：步骤1：向脂肪组织中加入基础培养基后，再加入I型胶原酶进行消化，重悬消化液后进行离心，取沉淀即为脂肪间充质干细胞；步骤2：收集步骤1离心后上层脂肪组织，加入基础培养基进行培养，当细胞汇合度为80%~90%时，加入胰蛋白酶进行消化，重悬消化液后，过滤、离心，取沉淀即为脂肪间充质干细胞；步骤3：收集步骤1和步骤2获得的脂肪间充质干细胞；所述I型胶原酶的质量浓度为0.01%。在I型胶原酶溶液同等用量下，本专利技术采用低浓度0.01wt%I型胶原酶溶液来消化脂肪组织，降低分离成本的同时可以降低I型胶原酶对细胞的伤害，提高细胞活率；另外，脂肪组织中加入无血清培养基后再进行消化，可以在消化过程中维持细胞的生长繁殖，提高间充质干细胞的提取率。由于在I型胶原酶消化过程中无血清培养基的加入，使得未完全消化掉的脂肪组织中的细胞还保持着较好的活性，因此，本申请对未完全消化掉的脂肪组织继续培养至细胞汇合度为80%~90%时，再使用胰蛋白酶进行消化，获取间充质干细胞。本专利技术脂肪组织经两次消化提取的间充质干细胞得率高，且细胞活率高。本专利技术步骤1中，每10mL所述脂肪组织加入2mL所述I型胶原酶进行消化，每10mL所述脂肪组织加入18mL所述基础培养基；所述基础培养基为脂肪间充质干细胞无血清培养基；所述消化的时间为60min~90min,优选为60min；消化结束后，优选采用生理盐水进行重悬消化液，再进行离心，取沉淀；所述离心的速率为1500r/min，时间为5min；取沉淀后，优选再采用生理盐水重悬沉淀，筛网过滤，离心后弃上清，得到的沉淀即为脂肪间充质干细胞；所述筛网为200目；所述离心的速率为1500r/min，时间为5min。本专利技术步骤2中，上层脂肪组织与基础培养基的体积比为1:4；所述基础培养基为脂肪间充质干细胞无血清培养基；当细胞汇合度为80%~90%，优选为80%时，加入胰蛋白酶进行消化，所述胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，再优选采用生理盐水对消化液进行重悬，优选采用100nm细胞过滤器进行过滤，离心，沉淀即为间充质干细胞；所述离心的速率优选为1500r/min，时间优选为5min。从以上技术方案可以看出，本专利技术具有以下优点：本专利技术提供了一种从脂肪组织中高效分离提取脂肪间充质干细胞的方法，该分离提取方法采用低浓度0.01%I型胶原酶溶液来消化脂肪组织，降低分离成本的同时可以降低I型胶原酶对细胞的伤害，提高细胞活率；另外，脂肪组织中加入无血清培养基后再进行消化，可以在消化过程中维持细胞的生长繁殖，提高间充质干细胞的提取率。由于在I型胶原酶消化过程中无血清培养基的加入，使得未完全消化掉的脂肪组织中的细胞还保持着较好的活性，因此，本申请对未完全消化掉的脂肪组织继续培养至细胞汇合度为80%~90%时，再使用胰蛋白酶进行消化，获取间充质干细胞。本专利技术脂肪组织经两次消化提取的间充质干细胞得率高，且细胞活率高。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。图1为本专利技术实施例二中分离提取得到的原代脂肪间充质干细胞的显微镜图（40×）；图2为本专利技术对比例一中分离提取得到的原代脂肪间充质干细胞的显微镜图（40×）；图3为本专利技术对比例二中分离提取得到的原代脂肪间充质干细胞的显微镜图（40×）；图4为本专利技术实施例二中第一代脂肪间充质干细胞的流式结果图；图5为本专利技术对比例一中第一代脂肪间充质干细胞的流式结果图；图6为本专利技术对比例二中第一代脂肪间充质干细胞的流式结果图。具体实施方式为使得本专利技术的专利技术目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而非全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术实施例中的试剂均为市购，其中，脂肪本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从脂肪组织中分离提取脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1：向脂肪组织中加入基础培养基后，再加入I型胶原酶进行消化，重悬消化液后进行离心，取沉淀即为脂肪间充质干细胞；/n步骤2：收集步骤1离心后上层脂肪组织，加入脂肪间充质干细胞无血清培养基进行培养，当细胞汇合度为80%~90%时，加入胰蛋白酶进行消化，重悬消化液后，过滤、离心，取沉淀即为脂肪间充质干细胞；/n步骤3：收集步骤1和步骤2获得的脂肪间充质干细胞；/n所述I型胶原酶的质量浓度为0.01%。/n

【技术特征摘要】
1.一种从脂肪组织中分离提取脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：向脂肪组织中加入基础培养基后，再加入I型胶原酶进行消化，重悬消化液后进行离心，取沉淀即为脂肪间充质干细胞；
步骤2：收集步骤1离心后上层脂肪组织，加入脂肪间充质干细胞无血清培养基进行培养，当细胞汇合度为80%~90%时，加入胰蛋白酶进行消化，重悬消化液后，过滤、离心，取沉淀即为脂肪间充质干细胞；
步骤3：收集步骤1和步骤2获得的脂肪间充质干细胞；
所述I型胶原酶的质量浓度为0.01%。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胰蛋白酶的质量浓度为0.25%。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中每10mL所述脂肪组织加入2mL所述I型胶原酶进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玲洁，吴基伟，郑婕，
申请(专利权)人：广州杜德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44