【技术实现步骤摘要】
一种从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法
本专利技术涉及一种从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，属于细胞生物学
技术介绍
旁分泌(paracrine)指某种细胞因子的产生细胞和靶细胞非同一细胞，但二者相邻近；该因子对靶细胞表现出的生物学作用即为旁分泌效应。旁分泌的信号分子包括生长因子、淋巴因子等。目前研究发现多种组织来源的干细胞都可分泌产生不同的细胞因子，即干细胞的旁分泌作用具有普遍性。间充质干细胞已用于治疗十余种难治性疾病的治疗研究，除了用来促进恢复造血，与造血干细胞共移植提高白血病和难治性贫血等以外，还用于心脑血管疾病、肝硬化、骨和肌肉衰退性疾病、脑和脊髓神经损伤、老年痴呆及红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病的治疗研究，已经取得的部分临床试验结果令人鼓舞。间充质干细胞作用机理尚不完全明确，一般认为主要通过以下机制：1、旁分泌作用(分泌细胞营养因子、细胞生长因子、抗凋亡因子等)。2、代替或修复死亡或受损的细胞。3、细胞直接接触，调控细胞的功能。越来越多的研究表明，间充质干细胞的旁分泌效应在其发挥治疗效果中起主要作...
【技术保护点】
1.一种从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，其特征在于：取采集的脂肪样本，用生理盐水洗涤1～3次；向洗涤后的脂肪组织中加入适量脂肪细胞消化液进行消化；消化后，离心，重悬细胞沉淀，用无血清培养基原代培养；传代培养；扩大培养；用旁分泌因子提取液提取，纯化，得旁分泌因子；/n所述旁分泌因子提取液，是由PBS缓冲液、L-谷氨酰胺、D-葡萄糖和L-抗坏血酸组成的，其中，L-谷氨酰胺、D-葡萄糖和L-抗坏血酸的浓度分别为：1～3mmol/L，10～20μmol/L，10～100μmol/L。/n
【技术特征摘要】
1.一种从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，其特征在于：取采集的脂肪样本，用生理盐水洗涤1～3次；向洗涤后的脂肪组织中加入适量脂肪细胞消化液进行消化；消化后，离心，重悬细胞沉淀，用无血清培养基原代培养；传代培养；扩大培养；用旁分泌因子提取液提取，纯化，得旁分泌因子；
所述旁分泌因子提取液，是由PBS缓冲液、L-谷氨酰胺、D-葡萄糖和L-抗坏血酸组成的，其中，L-谷氨酰胺、D-葡萄糖和L-抗坏血酸的浓度分别为：1～3mmol/L，10～20μmol/L，10～100μmol/L。
2.根据权利要求1所述的从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，其特征在于：所述脂肪细胞消化液，是由DMEM/F12培养基和Ⅰ型胶原酶组成的，Ⅰ型胶原酶的浓度为0.1％～0.3％。
3.根据权利要求1所述的从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，其特征在于：所述旁分泌因子提取液中，L-谷氨酰胺、D-葡萄糖和L-抗坏血酸的浓度分别为：2mmol/L，15μmol/L，50μmol/L。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，其特征在于：所述原代培养的具体方式如下：
(1)取采集的脂肪标本，离心；
(2)离心后，吸掉上层油脂，将中层脂肪组织转移至新的离心管中，等体积加入生理盐水，离心；
(3)重复步骤(2)两次，得脂肪组织；
(4)向脂肪组织中加入等体积的脂肪细胞消化液，混匀，放入37℃摇床，100转/min消化1.0h；
(5)消化后，离心；弃掉上层脂肪，细胞沉淀用DMEM/F12培养基重悬，用40um滤网过滤细胞，离心；弃上清，沉淀用DMEM/F12培养基重悬，计数，离心；弃上清，沉淀用无血清培养基进行重悬，置于培养瓶中铺瓶培养；当细胞生长密度达到80％时，进行脂肪干细胞传代培养。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，其特征在于：所述传代培养的具体方式如下：
(1)取出培养瓶，吸弃旧培养基，于非细胞培养面加入适量生理盐水，轻轻摇晃使其覆盖整个瓶底，吸弃细胞洗涤液，重复洗涤一次；
(2)向培养瓶中适量胰酶或胰酶溶液，37℃消化1min，当细胞明显回缩后，加入终止液终止消化；用100μm细胞筛网收集细胞，加入适量生理盐水，轻柔吹打后离心；弃上清，沉淀用适量生理盐水重悬，离心；弃上清，沉淀用无血清培养基进行重悬铺瓶，保证接种细胞密度在8×104/ml以上，置于培养箱中培养。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的从脂肪干细胞提取旁分泌因子的方法，其特征在于：所述扩...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵成，安文强，董白翔，
申请(专利权)人：北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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