【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种神经干细胞的冻存方法，属于细胞冻存。
技术介绍
1、细胞代谢过程需要各种蛋白酶的参与，而这些蛋白酶在环境温度低于-70℃时会集体罢工，低温贮藏的目的是通过超低温使细胞代谢活动近乎停止，细胞因此进入休眠状态，使细胞“不会老”，所以可以长期保存。
2、在细胞冻存时，降温速度、冰晶形成量和细胞渗透压改变程度是冻存成功与否的重要关键。若降温速度慢，则冰晶由细胞外开始形成，造成胞外渗透压变小，细胞内水分移动至细胞外造成细胞脱水。若降温速度快，虽然水分流动时间短，细胞内外渗透压改变程度小，但大量水分留在细胞内造成大量胞内冰晶形成，使得细胞器损坏。这些都可能引起细胞损伤、凋亡或坏死，也可能造成复苏后细胞存活率低、细胞形态改变、细胞功能丧失、基因变异等现象。由此可知，最适合的冻存条件为：在增加细胞渗透压稳定性的溶液中，以慢到能减少胞内冰晶形成，但也足够快到能预防细胞脱水的降温速度冻存细胞。
3、慢冻快融是在细胞冻存复苏时一直遵守的原则。慢冻可使细胞逐步脱水，且细胞内不会产生大量冰晶；慢冻有两种办法，一是手动降温，将细胞按照一定程序进行降温至-80℃后移至液氮中保存。二是使用程序降温盒，是一般最广泛使用的降温法，为一种特制冷冻容器(填充异丙醇或依靠特制金属导热)，使细胞以每分钟约-1℃的速度降至-80℃(过夜)，然后移至液氮中保存。程序降温精准度更高，优于手动降温。对于绝大多数哺乳动物细胞，1℃/min的降温速率是较合适的冻存速度，通过程序降温设备即可实现标准可控的冻存。市面上的程序降温设备主要利用液氮的
4、jasmin baboo等人发现当冻存时的降温速率在1℃/min甚至更低时，复苏时的加热速率(1.6～113℃/min范围内)对细胞活性并无明显影响；但当冻存时的降温速率在10℃/min时，复苏时较低的加热速率(1.6℃/min和6.2℃/min)会导致复苏后活细胞数量明显下降，但较高的加热速率(113℃/min和45℃/min)对于复苏后活细胞数量则没有明显影响。通过冷冻显微镜研究发现，细胞活性呈现的这种规律与冻存及复苏时冰晶结构变化是密切相关的，而冰晶形态又与降温速度密切相关。慢速降温时(1℃/min甚至更低)冰晶的结构较大且均衡，无论复苏的速率多少，冰晶结构都没有明显变化；但快速降温时(10℃/min)，冰结构表现出高度非晶形，表现为更细微的树突状结构，在复苏过程更容易形成再结晶，尤其接下来以较低加热速率(6.2℃/min或更低)复苏时，就很容易出现再结晶的现象，从而对细胞造成损害，影响细胞生物学活性；但用较高速率复苏快速降温(10℃/min)的细胞样品，冰晶没有足够时间形成再结晶，这是快融可以避免再结晶对细胞造成损害的原因。因此，对于细胞治疗产品，冻存工艺环节精确的控速降温对后续细胞药物的生物学活性是至关重要的。目前，尚无专用于神经干细胞的降温冻存程序，如果只是单纯的使用传统的1℃/min，达不到理想的效果。
技术实现思路
1、针对上述现有技术，本专利技术提供了一种神经干细胞的冻存方法。
2、本专利技术是通过以下技术方案实现的：
3、一种神经干细胞的冻存方法，如下：将待冻存的神经干细胞和冻存液混合，得到神经干细胞混合悬液，将混合悬液置于冻存管中进行冻存；所述冻存的程序为：
4、等待程序降温仪腔内温度到达4℃；
5、样品温度由初始温度降温至-4℃，降温速率为1.5℃/min；
6、腔内温度降温至-40℃，降温速率为30℃/min；
7、-40℃保持1min；
8、由-40℃升温至-15℃，升温速率为10℃/min；
9、由-15℃降温至-40℃，降温速率为25℃/min；
10、由-40℃降温至-90℃，降温速率为10℃/min；
11、-90℃保持30min。
12、进一步地，所述冻存液由以下组分组成：二甲基亚砜，5％～8％(体积百分数)；丙三醇，1％～5％(体积百分数)；人血白蛋白，10～50g/l；余量为基础培养基。所述基础培养基选自dmem/f12培养基。
13、进一步地，神经干细胞混合悬液中细胞浓度为5.0×106～2.0×107个/ml。
14、进一步地，所述初始温度为4～25℃。
15、进一步地，所述-90℃保持30min之后，液氮保存。
16、本专利技术的神经干细胞的冻存方法，通过合理设置神经干细胞的冻存程序，采用慢速降温，减少温度的剧烈波动，可以最大限度地降低冻存降温过程中对神经干细胞的影响，降低了细胞样品温度下降过程中相变时温度的剧烈跳动，尽量减少细胞内冰晶的形成，降低对细胞的损伤，能够使神经干细胞长期低温保存。
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1.一种神经干细胞的冻存方法，其特征在于：将待冻存的神经干细胞和冻存液混合，得到神经干细胞混合悬液，将混合悬液置于冻存管中进行冻存；所述冻存的程序为：
2.根据权利要求1所述的神经干细胞的冻存方法，其特征在于，所述冻存液由以下组分组成：二甲基亚砜，5％～8％；丙三醇，1％～5％；人血白蛋白，10～50g/L；余量为基础培养基。
3.根据权利要求2所述的神经干细胞的冻存方法，其特征在于：所述基础培养基选自DMEM/F12培养基。
4.根据权利要求1所述的神经干细胞的冻存方法，其特征在于：所述神经干细胞混合悬液中细胞浓度为5.0×106～2.0×107个/ml。
5.根据权利要求1所述的神经干细胞的冻存方法，其特征在于：所述初始温度为4～25℃。
6.根据权利要求1所述的神经干细胞的冻存方法，其特征在于：所述-90℃保持30min之后，液氮保存。
【技术特征摘要】
1.一种神经干细胞的冻存方法，其特征在于：将待冻存的神经干细胞和冻存液混合，得到神经干细胞混合悬液，将混合悬液置于冻存管中进行冻存；所述冻存的程序为：
2.根据权利要求1所述的神经干细胞的冻存方法，其特征在于，所述冻存液由以下组分组成：二甲基亚砜，5％～8％；丙三醇，1％～5％；人血白蛋白，10～50g/l；余量为基础培养基。
3.根据权利要求2所述的神经干细胞的冻存方法，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨玉翠，陈小威，冯冠强，穆乾，杨文杰，邓承航，
申请(专利权)人：北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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