一种犬脐带来源的间充质干细胞培养基和培养方法技术

本发明专利技术提供了一种犬脐带来源的间充质干细胞培养基和培养方法，所述培养基包含以下浓度的组分：10～20v/v％FBS、0.8～1.2mM丙酮酸钠、0.08～0.15mM甘氨酸、0.08～0.15mM L‑丙氨酸、0.08～0.15mM L‑天冬酰胺、0.08～0.15mM L‑天冬氨酸、0.08～0.15mM L‑谷氨酸、0.08～0.15mM L‑脯氨酸、0.08～0.15mM L‑丝氨酸、2～6mM谷氨酰胺。所述方法包括以下步骤：(1)采集新生犬脐带；(2)将步骤(1)获得的脐带进行清洗，剔除脐带动脉及静脉，剪碎；(3)使用消化液进行消化，获得脐带间充质干细胞；(4)使用上述培养基对步骤(3)获得的脐带间充质干细胞进行培养。上述培养方法可获得增殖能力和定向分化能力强的犬间充质干细胞，具有材料易得、操作简单和获得的间充质干细胞纯度高等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种犬脐带来源的间充质干细胞培养基和培养方法
本专利技术属于细胞生物学
，具体涉及一种犬脐带来源的间充质干细胞培养基和培养方法。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是干细胞家族的重要成员，存在于骨髓、脐带、脂肪、胎盘等多种组织中。MSCs具有高度增殖潜力和多向分化能力，在特定条件下，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多种细胞。MSCs来源广、分离培养操作简单、可以大量培养扩增，是干细胞治疗的理想种子细胞，具有广阔的临床应用前景。脐带来源的间充干细胞材料易得，不会对动物造成伤害，避免了伦理道德争议。而犬在人们生活中扮演着多重角色，不仅是比较受欢迎的宠物，也可训练成为导盲犬等工作犬，还是重要的临床药物试验的动物模型。目前，犬类上常用的MSCs主要来源于骨髓和脂肪组织，但是通过这两种来源获取干细胞对动物会造成不同程度的伤害，而脐带虽然是动物生产时产生的废弃物，但也是MSCs的来源之一，因此脐带，以犬类脐带为材料制备脐带来源的MSCs将是以后理想的替代物。
技术实现思路
基于此，本专利技术的目的在于提供一种犬脐带来源的间充质干细胞培养基和培养方法，所述培养基和方法培养获得的间充质干细胞具有增殖能力强的优点，可定向诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞，且操作简单。具体技术方案为：一种间充质干细胞培养基，所述培养基包含以下浓度的组分：10～20v/v％FBS、0.8～1.2mM丙酮酸钠、0.08～0.15mM甘氨酸、0.08～0.15mML-丙氨酸、0.08～0.15mML-天冬酰胺、0.08～0.15mML-天冬氨酸、0.08～0.15mML-谷氨酸、0.08～0.15mML-脯氨酸、0.08～0.15mML-丝氨酸、2～6mM谷氨酰胺。在其中一些实施例中，所述培养基包含以下浓度的组分：10～15v/v％FBS、0.9～1mM丙酮酸钠、0.1～0.12mM甘氨酸、0.1～0.12mML-丙氨酸、0.1～0.12mML-天冬酰胺、0.1～0.12mML-天冬氨酸、0.1～0.12mML-谷氨酸、0.1～0.12mML-脯氨酸、0.1～0.12mML-丝氨酸、2～4mM谷氨酰胺。在其中一些实施例中，所述培养基包含以下浓度的组分：10v/v％FBS、1mM丙酮酸钠、0.1mM甘氨酸、0.1mML-丙氨酸、0.1mML-天冬酰胺、0.1mML-天冬氨酸、0.1mML-谷氨酸、0.1mML-脯氨酸、0.1mML-丝氨酸、2mM谷氨酰胺。在其中一些实施例中，所述培养基中还含有抗生素。在其中一些实施例中，所述培养基的溶剂为低糖DEME培养基。所述低糖DEME培养基是指葡萄糖浓度为1000mg/L的DEME培养基。本专利技术还提供了上述培养基在培养间充质干细胞中的用途。本专利技术还提供了一种间充质干细胞的培养方法。具体技术方案为：一种间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：(1)采集新生犬脐带；(2)将步骤(1)获得的脐带进行清洗，剔除脐带动脉及静脉，剪碎；(3)使用消化液进行消化，获得脐带间充质干细胞；(4)使用上述培养基对步骤(3)获得的脐带间充质干细胞进行培养。在其中一些实施例中，步骤(3)所述消化液的制备方法如下：将0.2w/v％胶原酶IV、0.25w/v％胰酶、0.1w/v％透明质酸酶按体积比为2：(0～2)：(0～2)混合均匀。在其中一些实施例中，步骤(3)所述消化液的制备方法如下：将0.2w/v％胶原酶IV、0.25w/v％胰酶、0.1w/v％透明质酸酶按体积比为2：(0.5～1)：(0.5～1)混合均匀。在其中一些实施例中，优选所述消化液的制备方法如下：将0.2w/v％胶原酶IV、0.25w/v％胰酶、0.1w/v％透明质酸酶按体积比为2：1：1混合均匀。该消化液具有消化效果更好和对细胞的损伤更小的优点，可获取大量增殖能力较强的间充质干细胞。在其中一些实施例中，所述消化液的反应条件为37±1℃消化25～35min。在其中一些实施例中，优选所述消化液的反应条件为37±1℃消化30min。在其中一些实施例中，所述步骤(1)将采集到的新生犬脐带置于犬脐带保存液中；所述犬脐带保存液为含为抗生素的低糖DMEM培养基。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了一种非常适用于原代分离培养犬类脐带来源的间充质干细胞的方法，所述方法先使用优化的消化液对经过前处理的新生犬脐带进行消化，获得犬脐带来源的间充质干细胞，再使用含合适细胞生长添加剂的培养液进行培养，可获得增殖能力和定向分化能力强的间充质干细胞。所述消化液具有消化效果好和对细胞的损伤较小的优点，可获取大量增殖能力较强的间充质干细胞；所述培养液添加了适合犬类脐带来源的间充质干细胞生长的多种细胞生长添加剂，各细胞生长添加剂之间相互配合，可有效提升间充质干细胞的细胞活力和定向诱导分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的能力。此外，本专利技术方法还具有材料易得、操作简单和获得的间充质干细胞纯度高等优点。附图说明图1为实施例2实验组中培养获得的间充质干细胞的形态鉴定结果图。图2为实施例2实验组中培养获得的间充质干细胞的生长曲线图。图3为实施例2实验组和对照组中培养获得的间充质干细胞的细胞活力检测结果图。图4为实施例2实验组中培养获得的间充质干细胞的免疫荧光鉴定结果图。图5为实施例2实验组和对照组中培养获得的间充质干细胞的免疫荧光鉴定比较结果图。图6为实施例2实验组培养获得的间充质干细胞诱导分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的检测结果图。图7为实施例8中实验组1～5培养获得的间充质干细胞的细胞活力检测结果图。图8为实施例8中实验组1～5培养获得的间充质干细胞的免疫荧光鉴定结果图(CD90和CD105)。图9为实施例8中实验组1～5培养获得的间充质干细胞的免疫荧光鉴定结果图(CD44和CD34)。具体实施方式本专利技术下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。除非另有定义，本专利技术所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本专利技术。本专利技术的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。在本专利技术中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种间充质干细胞培养基，其特征在于，所述培养基包含以下浓度的组分：10～20v/v％FBS、0.8～1.2mM丙酮酸钠、0.08～0.15mM甘氨酸、0.08～0.15mM L-丙氨酸、0.08～0.15mM L-天冬酰胺、0.08～0.15mM L-天冬氨酸、0.08～0.15mM L-谷氨酸、0.08～0.15mML-脯氨酸、0.08～0.15mM L-丝氨酸、2～6mM谷氨酰胺。/n

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞培养基，其特征在于，所述培养基包含以下浓度的组分：10～20v/v％FBS、0.8～1.2mM丙酮酸钠、0.08～0.15mM甘氨酸、0.08～0.15mML-丙氨酸、0.08～0.15mML-天冬酰胺、0.08～0.15mML-天冬氨酸、0.08～0.15mML-谷氨酸、0.08～0.15mML-脯氨酸、0.08～0.15mML-丝氨酸、2～6mM谷氨酰胺。


2.根据权利要求1所述的间充质干细胞培养基，其特征在于，所述培养基包含以下浓度的组分：10～15v/v％FBS、0.9～1mM丙酮酸钠、0.1～0.12mM甘氨酸、0.1～0.12mML-丙氨酸、0.1～0.12mML-天冬酰胺、0.1～0.12mML-天冬氨酸、0.1～0.12mML-谷氨酸、0.1～0.12mML-脯氨酸、0.1～0.12mML-丝氨酸、2～4mM谷氨酰胺。


3.根据权利要求1所述的间充质干细胞培养基，其特征在于，所述培养基中还含有抗生素。


4.根据权利要求1所述的间充质干细胞培养基，其特征在于，所述培养基的溶剂为低糖DEME培养基。


5.如权利要求1～4任一项所述的培养基在培养间充质干细胞中的用...

【专利技术属性】
技术研发人员：王国栋，张树润，李欣懿，
申请(专利权)人：中国科学院昆明动物研究所，北京中科昆朋生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：云南;53