NK细胞的扩增方法技术

本发明专利技术开发出一种在试管内由采集的血细胞使NK细胞扩增来制备细胞疗法的最佳数量的NK细胞的技术。本发明专利技术提供一种NK细胞的扩增方法。本发明专利技术的NK细胞的扩增方法包括：制备包含NK细胞的细胞群的步骤；从所述包含NK细胞的细胞群中将T细胞除去的步骤；和在包含2500IU/mL至2813IU/mL的IL-2的培养基中培养除去了所述T细胞后的剩余的细胞的步骤。有时本发明专利技术的NK细胞的扩增方法包括，从所述包含NK细胞的细胞群中将造血前体细胞除去的步骤。本发明专利技术提供一种用于细胞疗法的医药组合物，其包含通过本发明专利技术的NK细胞的扩增方法而制备的NK细胞。有时本发明专利技术的用于细胞疗法的医药组合物用于治疗传染病和/或癌症。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】NK细胞的扩增方法
本专利技术涉及可以高纯度及高扩增倍率来扩增具有高溶细胞活性(細胞傷害活性)的自然杀伤细胞(NK细胞)的方法、和包含通过该方法而得到的NK细胞的医药组合物。
技术介绍
NK细胞并不攻击表达MHC类I型分子的正常细胞，而主要攻击MHC类I型分子的表达降低及缺损的细胞。因此，如果在癌症及传染病的细胞疗法使用该种NK细胞，则具有可以回避GVH (Graft-versus-host,移植物抗宿主)病的副作用的优点。实际上,根据Miller等人(非专利文献I)及Rubnitz等人(非专利文献2)的报告，在将癌症患者作为受体、并在将NK细胞浓缩了的基础上移植其近亲的健康者供体的新鲜外周血单核细胞时，被移植的NK细胞不会对受体引起副作用，而暂时地存活，并保持溶细胞活性。但是，尚未有显示出NK细胞的移植疗法有效性的临床治疗试验的报告。其理由之一在于，可从供体通过淋巴球血液成分单采而回收的细胞数量是有限的，因而在直到目标细胞灭绝为止的期间，无法使为使癌细胞及病原体感染细胞这样的目标细胞灭绝所需要的足够数量的NK细胞滞留在受体体内。由正常成人的外周血的I次血液成分单采可回收约I X 101°个的单核细胞，如果将外周血单核细胞中的NK细胞的构成比率设为约7%，则可以得到7 X IO8个NK细胞(非专利文献3)。另一方面，NK细胞的移植中，使用I X IO5个/kg至2X IO7个/kg (非专利文献I)、或者5 X IO5个/kg至8.1 X IO7个/kg (非专利文献2)的数量级的NK细胞。如果将患者的体重设为60kg，则将需要6 X IO6个至4.8 X IO9个的NK细胞。这相当于由正常成人的外周血的I次血液成分单采而得到的NK细胞的0.0086倍至6.86倍。但是，例如根据非专利文献2，并未发现NK细胞的存活时间与给予的NK细胞的数量相关，在2天至189天内，存活时间的中间值仅为10天。由 此，在直到目标细胞灭绝为止的期间，为了使为使癌细胞及病原体感染细胞这样的目标细胞灭绝所需要的足够数量的NK细胞滞留在受体体内，需要频繁地重复NK细胞的移植，这对患者而言将成为极大的负担。因此，正在推进使由供体得到的NK细胞先在试管内培养扩增，来得到为使目标细胞灭绝所需要的足够的NK细胞的技术的开发。Terunuma, H.等人(专利文献I)在对人⑶3的激动剂抗体即0KT3、IL-2、抗CD16抗体的存在下，将健康者的外周血单核细胞培养13天，使NK细胞扩增至纯度81.2%、130倍。此外，所述NK细胞对K562细胞的溶细胞活性(E:T=3:O为66%。Tanaka, J.等人(专利文献2)通过使用添加了 IL-2、IL-15、抗CD3抗体、5%的人AB型血清、他克莫司(tacrolimus)及达肝素钠(dalteparin)的培养基的方法,将健康者的外周血单核细胞培养21天，使NK细胞扩增至纯度73.4%,6268倍。此外，所述NK细胞对K562细胞的溶细胞活性(E:T=1:1)约为55%。Carlens, S.等人(非专利文献4)报告了:在对人CD3的激动剂抗体即0ΚΤ3、IL-2的存在下，将健康者的外周血单核细胞培养21天，使NK细胞扩增至纯度55%、193倍。此外，所述NK细胞对Κ562细胞的溶细胞活性(Ε:Τ=1:1)为45%。Alici1E.等人(非专利文献5)报告了:在同样的条件下将骨髓瘤患者的外周血单核细胞培养20天，使NK细胞扩增至纯度65%、1625倍。此外，所述NK细胞对K562细胞的溶细胞活性(E:T=1:1)约为10%。Fujisaki1H.等人(非专利文献6)报告了:在使用白血病细胞作为饲养细胞的培养条件下，将健康者的外周血单核细胞培养21天，使NK细胞扩增至纯度96.8%,277倍，其中所述白血病细胞被进行了遗传性改变以表达使NK细胞活性化的因子。此外，所述NK细胞对Κ562细胞的溶细胞活性(Ε:Τ=1:1)的最大值约为90%。通过Terunuma, H.等人(专利文献 I)、Tanaka, J.等人(专利文献 2)、Carlens, S.等人(非专利文献4)及Alici，E.等人(非专利文献5)的方法而扩增的NK细胞的溶细胞活性(E:T=1:1)分别为66%、约55%、45%及约10%。因此，在以往技术中，NK细胞的溶细胞活性低，因此治疗效果低，NK细胞的施用数增大，因而并不优选。在Fujisaki，H.等人(非专利文献6)的方法中，扩增后的NK细胞的溶细胞活性约为90% (最大值)。但是，由于使用被遗传性改变了的肿瘤细胞作为饲养细胞，因此存在该细胞混入最终产物的风险，因而并不优选。现有技术文献专利文献专利文献1:日本特开2007-297291号公报专利文献2:日本特愿2011-140504号申请说明书非专利文献非专利文献1:Miller, J.S.等人，Blood，105:3051 (2005)非专利文献2:Rubnitz, J.Ε.等人，J.Clin.0ncol.，28:955 (2010)非专利文献3:Cho, D.及 Campana, D.，Korean J.Lab.Med.，29:89 (2009)`非专利文献4:Carlens, S.等人，Hum.Tmmunol.,62:1092 (2001)非专利文献5:Alici，E.等人，Blood、111:3155 (2008)非专利文献6:Fujisaki, H.等人，Cancer Res.,69:4010 (2009)
技术实现思路
专利技术所要解决的课题因此，需要开发在不使用饲养细胞的情况下，由脐带血、或外周血都可以高纯度地扩增具有高溶细胞活性的NK细胞的技术。用于解决课题的方法本专利技术提供一种NK细胞的扩增方法。本专利技术的NK细胞的扩增方法包括:制备包含NK细胞的细胞群的步骤；从所述包含NK细胞的细胞群中将T细胞除去的步骤；和在包含2500IU/mL至2813IU/mL的IL-2的培养基中培养除去了所述T细胞后的剩余的细胞的步骤。在本专利技术的NK细胞的扩增方法中，有时从所述包含NK细胞的细胞群中将所述T细胞除去的步骤是通过将CD3阳性细胞除去的步骤来实现的。有时本专利技术的NK细胞的扩增方法包括从所述包含NK细胞的细胞群中将造血前体细胞除去的步骤。在本专利技术的NK细胞的扩增方法中，有时从所述包含NK细胞的细胞群中将所述造血前体细胞除去的步骤是通过将CD34阳性细胞除去的步骤来实现的。在本专利技术的NK细胞的扩增方法中，有时所述培养基包含自体血清、AB型血清和/或血清白蛋白。在本专利技术的NK细胞的扩增方法中，有时制备所述包含NK细胞的细胞群的步骤是通过从采集自受试者的血细胞中将单核细胞分离的步骤来实现的。在本专利技术的NK细胞的扩增方法中，有时所述血细胞采集自外周血、脐带血、骨髓和/或淋巴结。在本专利技术的NK细胞的扩增方法中，有时通过血液成分单采术从外周血采集所述血细胞。在本专利技术的NK细胞的扩增方法中，有时所述包含NK细胞的细胞群由选自源于干细胞的造血干细胞、源于脐带血的造血干细胞、源于外周血的造血干细胞、源于骨髓血的造血干细胞、脐带血单核细胞、和外周血单核细胞中的至少I种细胞来制备，其中所述干细胞为选自胚胎干细胞、成体干细胞及人本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种NK细胞的扩增方法，其特征在于，包括：制备包含NK细胞的细胞群的步骤；从所述包含NK细胞的细胞群中将T细胞除去的步骤；和在包含2500IU/mL至2813IU/mL的IL?2的培养基中培养除去了所述T细胞后的剩余的细胞的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.06.24 JP 2011-140725;2012.02.03 JP 2012-02191.一种NK细胞的扩增方法，其特征在于，包括: 制备包含NK细胞的细胞群的步骤； 从所述包含NK细胞的细胞群中将T细胞除去的步骤；和 在包含2500IU/mL至2813IU/mL的IL-2的培养基中培养除去了所述T细胞后的剩余的细胞的步骤。2.根据权利要求1所述的NK细胞的扩增方法，其特征在于，从所述包含NK细胞的细胞群中将所述T细胞除去的步骤是通过将CD3阳性细胞除去的步骤来实现的。3.根据权利要求1或2所述的NK细胞的扩增方法，其特征在于，包括从所述包含NK细胞的细胞群中将造血前体细胞除去的步骤。4.根据权利要求3所述的NK细胞的扩增方法，其特征在于，从所述包含NK细胞的细胞群中将所述造血前体细胞除去的步骤是通过将CD34阳性细胞除去的步骤来实现的。5.根据权利要求1至4中任一项所述的NK细胞的扩增方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：米满吉和，原田结，齐藤智，矢崎雄一郎，冈本正人，石田尾武文，
申请(专利权)人：国立大学法人九州大学，泰来株式会社，
类型：
国别省市：