胚胎干细胞来源的心肌细胞以及包含所述心肌细胞作为活性成分的细胞治疗剂制造技术

本发明专利技术涉及产生胚胎干细胞来源的心肌细胞的方法和由所述方法产生的心肌细胞、由心肌细胞产生心肌细胞聚集体的方法和由所述方法产生的心肌细胞聚集体、用于治疗心脏病的包含所述心肌细胞聚集体作为活性成分的细胞治疗产品、使用所述细胞治疗产品治疗心脏病的方法、以及心肌细胞和心肌细胞聚集体用于产生细胞治疗产品的用途。通过使用本发明专利技术的产生心肌细胞的方法，可以容易地纯化胚胎干细胞来源的心肌细胞，并且心肌细胞聚集体可以由纯化的心肌细胞产生，因此可用作可以用于治疗心脏病的细胞治疗产品。因此，本发明专利技术可以广泛用于开发用于预防或治疗多种心脏病的制剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及胚胎干细胞来源的心肌细胞和包含所述心肌细胞作为活性成分的细胞治疗剂。更具体地，本专利技术涉及产生胚胎干细胞来源的心肌细胞的方法、由所述方法产生的心肌细胞、由所述心肌细胞产生心肌细胞体的方法、由所述方法产生的心肌细胞体、包含所述心肌细胞体作为活性成分用于治疗心脏病的细胞治疗剂以及使用所述细胞治疗剂治疗心脏病的方法。
技术介绍
胚胎干细胞(ESC)来源的心肌细胞(CM)可以用于心血管疾病的再生疗法，因此许多研究人员已经开发出了多种使CM分化并分离CM的技术。但是，这些方法在其实际应用中遇到了由于CM产率低所带来的困难。已通过显微切割从收缩性人胚状体(hEB)中分离出CM。已知hEB的形成会诱导未分化的hESC形成收缩性CM，但是通过这种方法形成CM还有一些缺点。首先，在三维培养中，hEB不会表现出三个胚层所特有的分裂模式。第二，分化的细胞与不同细胞谱系的细胞相混。第三，难以分离出高浓度的CM。因此，许多研究人员已经尝试着通过机械分离、Percoll密度梯度分离并通过使用KDR、⑶15和⑶16来分离大量的CM。但是，通过这些方法不能完全地分离出纯的CM细胞，因此在其临床应用中依然有缺陷。由于缺乏CM特异的表面标志物，也难以将常规培养方法应用于CM分离中。为了克服这些问题，使用重组慢病毒载体系统通过转导产生了 MLC-2V诱导的表达GFP的hESC，并通过FACS分离将hESC用于从hEB分离CM。但是，由于病毒DNA能够整合至hEB的DNA中，hESC的这一临床应用大受局限。另外，通过显微切割从收缩性hEB分离CM具有这样一个问题，即由于其与内胚层细胞 而非外胚层细胞可以共存的这一特征，CM与其他内胚层谱系细胞相混，目前正在积极地进行多项研究来解决这一问题。另一方面，同样重要的一个因素是获得足量的CM来用作心血管疾病的治疗剂，因为成熟的CM具有有限的增殖活力。对于这一研究，已经开发出了使用生长因子或者END-2共培养体系(其中内胚层细胞系提供CM增殖和分化)的多种分化方法。但是，由于要使用生长因子，这一方法花费昂贵，并且还有从与其共培养的END-2细胞进一步分离CM的不便。因此，需要能够为针对心脏病的基于细胞的疗法提供高效高产率的产生和分离CM的方法。
技术实现思路
技术问题在这一背景下，本专利技术人经过诸多努力，开发出了高效高产率纯化ESC分化的心肌细胞的方法。因此，他们开发出了使用无血清培养基纯化ESC分化的心肌细胞的方法，并发现拟用于治疗心脏病的心肌细胞体(CB)可以通过在无血清培养基中悬浮培养经纯化的CM来产生，由此完成了本专利技术。技术方案本专利技术的一个目的是提供由胚胎干细胞产生心肌细胞的方法，包括:Ca)培养胚胎干细胞，以获得培养物；并6)在无血清培养基中培养所述培养物，以纯化心肌细胞。本专利技术的另一个目的是提供通过所述方法产生的心肌细胞。本专利技术的又一个目的是提供产生心肌细胞体的方法，包括:(a)培养胚胎干细胞，以获得培养物；(b)在无血清培养基中培养所述培养物，以纯化成心肌细胞；并((3)在无血清培养基中培养所述经纯化的成心肌细胞。本专利技术的另一个目的是提供通过所述方法产生的心肌细胞体。本专利技术的另一个目的是提供用于治疗心脏病的细胞治疗剂，其包含作为活性成分的所述心肌细胞体。本专利技术的另一个目的是提供治疗心脏病的方法，其包括将所述细胞治疗剂给予个体的步骤。有益效果本专利技术的产生心肌 细胞的方法可用于容易地纯化胚胎干细胞分化的心肌细胞，无需另外的设备。另外，经纯化的心肌细胞可用于产生心肌细胞体，其可用作用于治疗心脏病的细胞治疗剂。因此，可以将心肌细胞体广泛地应用于开发针对心脏病的预防剂或治疗剂。附图说明图1至4:对来源于人胚胎干细胞的收缩性EB的细胞组分分析。(图1，左图)当在含有20%FBS的DMEM培养基中悬浮培养15天时，出现了来源于人胚胎干细胞的分化的收缩性EB。(图1，中图)表达CM特异的标志物cTnT的细胞以团块形式(clump)部分地位于收缩性EB中。(图1，右图)第二幅图中的白色方框的放大图。(图2，左图)在0.1%明胶包被的平板上分离收缩性和非收缩性区域，之后将收缩性EB铺板。(图2，中图和右图)收缩性细胞簇区域中的细胞表达CM特异的标志物cTnT和sMHC。(图3)EB收缩性区域(Ib)和非收缩性区域中心脏谱系相关基因的表达模式。与非收缩性区域相比，收缩性区域中心脏转录相关基因(NKX2.5和MEF-2c)和CM相关基因(Myh6、Myh7、MLC-2v和TnT)的表达升高。误差棒表示三次实验的平均值。(图4)图1b的收缩性细胞簇由0.05%胰蛋白酶-ETDA处理机械地切割，然后将该细胞重新铺板于0.1%明胶包被的平板上。(图4，左图)在重新铺板的细胞群中，收缩性细胞与非收缩性细胞共存。(图4，中图和右图)免疫细胞化学分析表明，收缩性细胞为CM标志物sMHC或cTnT阳性，相反，非收缩性细胞不表达CM标志物，但是表达内胚层谱系特异的标志物Foxa2或 AFP。图5至11:从重新铺板于含有N2的无血清培养基上的非收缩性细胞群中有效地纯化收缩性细胞，以及对心室型CM的浓缩。(图5，左图)含有N2的无血清培养基中的大部分细胞均表现出收缩性，并且强烈地表达cTnT(图5，中图)或sMHC(图5，右图)。(图6，左图)当从在含血清(2%FBS)培养基中培养的收缩性细胞簇中分离细胞时，本专利技术人发现非收缩性细胞和收缩性细胞共存。(图6，中图和右图)含血清培养基中的收缩性细胞和非收缩性细胞分别表达cTnT 和 sMHC。(图7)在含血清培养基或无血清培养基中培养分离的细胞后第14天，表达CM标志物的细胞相对表达DAPI的细胞的百分比。误差棒表示五次实验的平均值。(图8)含血清和无血清条件下培养的细胞中心脏相关基因和内胚层谱系相关基因的表达模式。使用样本的cDNA进行定量RT-PCR，并相对GAPDH将每个值标准化。(图8a和8b)无血清条件下，CM相关基因(Myh6、Myh7、MLC_2v和TnT)表达升高，内胚层谱系相关基因(Foxa2和AFP)表达下降。无血清组的数据被表示为通过血清组标准化的比值。误差棒表示三次实验的平均值。(图9)来源于人胚胎干细胞的CM的电生理特征。从血清组和无血清组记录到了三大类动作电位(结节型(Nodal-type)、心房型和心室型)。从标记区域(*)采集单个动作电位，并在扩展的时间标尺上示出。图9中,虚线表示OmV。(图10和11)含血清或无血清培养条件下三大类动作电位的比例。图中示出含血清组或无血清组中H9-和CHA15-人胚胎干细胞来源的心肌细胞的三大类动作电位。有趣的是，在被记录的细胞中，无血清条件下有80%的细胞表现出心室特征。图12至16:高度纯化的CM在高密度培养体系中增强的增殖能力。(图12，左图)纯化的 CM在含N2的无血清培养基中培养期间，观察到低密度的单细胞和(图12，右图，▲)高密度的形成集落的CM的收缩性。(图13)单CM和形成集落的CM之间在一段时间里的收缩性比较。(图14，左图)周围具有CM的非收缩性的单CM表达CM特异的标志物sMHC(红色)，但不表达增殖标志物K1-67 (绿色)。(图14，右图)一些形成集落的CM表达K1-67和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑炯敏，文盛焕，
申请(专利权)人：车比奥及戴奥斯泰有限公司，
类型：
国别省市：