来源于胚胎干细胞的间充质干细胞的制备方法及其用途技术

本发明专利技术公开了一种来源于胚胎干细胞的间充质干细胞的制备方法及其用途。它包括如下步骤：１）在胚胎干细胞培养液中培养胚胎干细胞。２）在分化培养液中使胚胎干细胞分化为间充质干细胞。３）在间充质干细胞培养液中培养胚胎干细胞来源的间充质干细胞并用于修复失去功能的器官或病变组织或用于药物筛选。本发明专利技术具有的优点是：１）来源于胚胎干细胞的间充质干细胞为一种新型的干细胞，其兼具胚胎干细胞和间充质干细胞的优势，来源广泛，生物安全性好。２）应用来源于胚胎干细胞的间充质干细胞修复损伤组织或器官的方法简单，可操作性强，生物相容性好。３）应用来源于胚胎干细胞的间充质干细胞筛选药物可实现高通量，低成本，操作简单，适用范围广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种来源于胚胎干细胞的间充质干细胞的制备方法及其用途。
技术介绍
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。它包括胚胎干细胞和成体干细 胞。干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。目前胚胎干细胞已可成功地在体 外培养，并在特定的培养条件下定向诱导分化为各种功能细胞，进而再生各种组织器官，用 于修复受损或病变的组织和器官，然而胚胎干细胞培养难度大、成本高，存在潜在的成瘤性 风险，而且存在移植排斥的可能，限制了其在医学研究上的应用。成体干细胞如间充质干细 胞可以横向分化为其他类型的细胞和组织，间充质干细胞没有成瘤风险，并能有效的调节 免疫系统，逃避免疫排斥，为干细胞的广泛应用提供了基础，但成体干细胞又因为供体来源 不足，分离纯化技术不稳定，影响了其在医学研究上的广泛应用。因而寻找一种安全有效， 来源广泛，操作简便，培养成本低的新型干细胞对于干细胞的研究和应用十分关键。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足提供一种来源于胚胎干细胞的间充质干细 胞的制备方法及其用途。 来源于胚胎干细胞的间充质干细胞的制备方法包括以下步骤 1)在胚胎干细胞培养液中将胚胎干细胞培养到106 107个胚胎干细胞； 2)用分化培养液预处理胚胎干细胞1 2小时，采用胰蛋白酶消化使胚胎干细胞分散成单个的胚胎干细胞，于分化培养液中培养12 24小时，再用间充质干细胞培养液继续培养得到胚胎干细胞来源的间充质干细胞； 3)在间充质干细胞培养液中扩大培养胚胎干细胞来源的间充质干细胞到108 109个细胞。所述的胚胎干细胞培养液的组成为80ml knock-out DMEM， 20ml SR， 2mML_谷氨 酰胺，O. lmMP -巯基乙醇，10ng/ml bFGF， 1000U/ml的白细胞抑制因子LIF，O. ImM MEM。 所述的分化培养液的组成为10%血清+90% DMEM培养液+10 100 ii MRho偶联 激酶抑制剂，分子式为C14H21N30 2HC1 H20。 所述的间充质干细胞培养液的组成为15%血清+85% DMEM培养液。 来源于胚胎干细胞的间充质干细胞用于组织或器官损伤修复或药物筛选。本专利技术具有的有益效果是 1)来源于胚胎干细胞的间充质干细胞为一种新型的干细胞，其兼具胚胎干细胞和 间充质干细胞的优势，来源广泛，生物安全性好。 2)应用来源于胚胎干细胞的间充质干细胞修复损伤组织或器官的方法简单，可操 作性强，生物相容性好。 3)应用来源于胚胎干细胞的间充质干细胞筛选药物可实现高通量，低成本，操作简单，适用范围广。 附图说明 图1是经流式细胞检测仪检测，胚胎干细胞来源的间充质干细胞表现出成体间充质干细胞特征示意图，如图所示胚胎干细胞来源的间充质干细胞表现出如下表面分子特征:CD34阴性，CD45阴性，CD73阳性，CD105阳性，CD166阳性，STR0-1阴性; 图2是经胚胎干细胞来源的间充质干细胞移植治疗后，肝损伤小鼠血清中转氨酶水平明显降低，白蛋白和总蛋白水平明显升高示意图。具体实施例方式本专利技术利用了胚胎干细胞诱导得到了一种新型的间充质样干细胞。具体而言，胚 胎干细胞来源的间充质干细胞既具有成体间充质干细胞适用性强、免疫调节效果明显的优 点，又不受成体间充质干细胞来源和细胞数量的限制。运用胚胎干细胞来源的干细胞治疗 组织损伤方法简单，可操作性强，生物相容性好。 实施例1 1)在胚胎干细胞培养液中将胚胎干细胞培养到106个胚胎干细胞；所述的胚胎干 细胞培养液的组成为80ml knock-out DMEM， 20ml SR， 2mM L-谷氨酰胺，0. lmM P -巯基乙 醇，10ng/ml bFGF， 1000U/ml的白细胞抑制因子LIF，0. lmM MEM。 2)用分化培养液预处理胚胎干细胞1小时，采用胰蛋白酶消化使胚胎干细胞分散 成单个的胚胎干细胞，于分化培养液中培养12小时，再用间充质干细胞培养液继续培养得 到胚胎干细胞来源的间充质干细胞；所述的分化培养液的组成为10%血清+90% DMEM培 养液+10 ii M Rho偶联激酶抑制剂，分子式为C14H21N30 2HC1 H20。 3)在间充质干细胞培养液中扩大培养胚胎干细胞来源的间充质干细胞到108个细胞；所述的间充质干细胞培养液的组成为15%血清+85% DMEM培养液。 如上所述得到的胚胎干细胞来源的间充质干细胞具有间充质干细胞的表面分子特征(图1)。 实施例2 1)在胚胎干细胞培养液中将胚胎干细胞培养到107个胚胎干细胞；所述的胚胎干 细胞培养液的组成为80ml knock-out DMEM， 20ml SR， 2mM L-谷氨酰胺，0. lmM P -巯基乙 醇，10ng/ml bFGF， 1000U/ml的白细胞抑制因子LIF，0. lmM MEM。 2)用分化培养液预处理胚胎干细胞2小时，采用胰蛋白酶消化使胚胎干细胞分散 成单个的胚胎干细胞，于分化培养液中培养24小时，再用间充质干细胞培养液继续培养得 到胚胎干细胞来源的间充质干细胞；所述的分化培养液的组成为10%血清+90% DMEM培 养液100 ii M Rho偶联激酶抑制剂，分子式为C14H21N30 2HC1 H20。 3)在间充质干细胞培养液中扩大培养胚胎干细胞来源的间充质干细胞到109个细 胞；所述的间充质干细胞培养液的组成为15%血清+85% DMEM培养液。 实施例3 1)在胚胎干细胞培养液中将胚胎干细胞培养到107个胚胎干细胞；所述的胚胎干 细胞培养液的组成为80ml knock-out DMEM， 20ml SR， 2mM L-谷氨酰胺，0. lmM P -巯基乙4醇，10ng/ml bFGF， lOOOU/ml的白细胞抑制因子LIF，0. lmM MEM。 2)用分化培养液预处理胚胎干细胞1小时，采用胰蛋白酶消化使胚胎干细胞分散成单个的胚胎干细胞，于分化培养液中培养12 24小时，再用间充质干细胞培养液继续培养得到胚胎干细胞来源的间充质干细胞；所述的分化培养液的组成为10%血清+90%匿EM培养液+10 ii M Rho偶联激酶抑制剂，分子式为C14H21N30 2HC1 H20。 3)在间充质干细胞培养液中扩大培养胚胎干细胞来源的间充质干细胞到109个细胞；所述的间充质干细胞培养液的组成为15%血清+85% DMEM培养液。 实施例4 1)将胚胎干细胞培养到所需细胞数107，所用培养基为80mlknock-outDMEM (Sigma) ， 20ml SR (GIBCO) ， 2mM L-谷氨酰胺(GIBCO) ， 0. lmM P -巯基乙醇(Sigma) ， 10ng/ml bFGF (Sigma) ， lOOOU/ml的白细胞抑制因子LIF (Hyclone) ， 0. lmMMEM(Hyclone)。 2)用分化培养液预处理胚胎干细胞2小时，采用胰蛋白酶消化使胚胎干细胞分散成单个的胚胎干细胞，于分化培养液中培养24小时，再用间充质干细胞培养液继续培养得到胚胎干细胞来源的间充质干细胞；所述的分化培养液的组成为10%血清+90% DMEM培养液10 ii M Rho偶联激酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种来源于胚胎干细胞的间充质干细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：　　１）在胚胎干细胞培养液中将胚胎干细胞培养到１０↑［６］～１０↑［７］个胚胎干细胞；　　２）用分化培养液预处理胚胎干细胞１～２小时，采用胰蛋白酶消化使胚胎干细胞分散成单个的胚胎干细胞，于分化培养液中培养１２～２４小时，再用间充质干细胞培养液继续培养得到胚胎干细胞来源的间充质干细胞；　　３）在间充质干细胞培养液中扩大培养胚胎干细胞来源的间充质干细胞到１０↑［８］～１０↑［９］个细胞。

【技术特征摘要】
一种来源于胚胎干细胞的间充质干细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)在胚胎干细胞培养液中将胚胎干细胞培养到106～107个胚胎干细胞；2)用分化培养液预处理胚胎干细胞1～2小时，采用胰蛋白酶消化使胚胎干细胞分散成单个的胚胎干细胞，于分化培养液中培养12～24小时，再用间充质干细胞培养液继续培养得到胚胎干细胞来源的间充质干细胞；3)在间充质干细胞培养液中扩大培养胚胎干细胞来源的间充质干细胞到108～109个细胞。2. 根据权利要求1所述的一种来源于胚胎干细胞的间充质干细胞的制备方法，其特征 在于所述的胚胎干细胞培养液的组成为80ml knock-out DMEM， 20ml血清替代物SR， 2mM L-谷氨酰胺，O. lmMP -巯基乙...

【专利技术属性】
技术研发人员：张铭，谭舟，吴蓉蓉，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]