用于检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的基因元件及应用技术方案

本发明专利技术公开了一种用于检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的基因元件及应用。该基因元件包括有效连接的启动子、第一报告基因、REST基因、SV40pA基因、S沉默子、第二报告基因和终止子，其中，启动子与第一报告基因基因之间可插入被切割目标DNA序列，第一报告基因不同于第二报告基因，REST基因的表达能够抑制S沉默子后面第二报告基因的表达。用于检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的基因元件可作为核心元件连接到载体中，可以用来在活细胞胞内鉴定gRNA对基因组的切割效率，该检测具有产生移码突变时是即时荧光表现型、高稳定性的荧光表型和易操作性。

【技术实现步骤摘要】
用于检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的基因元件及应用
本专利技术涉及基因工程中的克隆技术和分子检测
，具体而言，涉及一种用于检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的基因元件及应用。
技术介绍
规律成簇的间隔短回文重复序列(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats，CRISPR)是大多数细菌及古细菌中的一种获得性免疫方式。2012年，Jinek等使用CRISPR/Cas9基因编辑系统对基因组DNA进行操作，并证实了这一系统可以在活体细胞实现RNA介导的基因编辑。至今，CRISPR/Cas9基因编辑系统广泛应用于目的基因编辑。特别是在诱导性多功能干细胞(InducedPluripotentStemcells，iPScells)或胚胎干细胞(EmbryonicStemCell，ESCs)中的应用，使用CRISPR/Cas9基因编辑系统修改基因组所获的细胞系可以模仿基因病患者，用于目的新药、特效药的研发；或失活特定突变的基因，达到基因编辑治疗疾病的目的。另一方面，由于CRISPR/Cas9基因编辑系统是RNA介导的，所以gRNA是否具有专一的切割位点是最核心的，制约CRISPR/Cas9基因编辑系统使用的因素，是决定前述目的实现的关键要素之一。因此，gRNA设计好坏决定目标基因组被切割的效率；专一性的gRNA可以减少脱靶几率，提高基因编辑的正确率，避免额外错误的编辑。所以，需要一种检测方法来快速鉴定所设计的gRNA对基因组的切割效率和编辑产生移码突变后的基因组碱基序列是怎样分布的。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种用于检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的基因元件及应用，以提供一种快速的、可在活细胞胞内鉴定gRNA对基因组的切割效率的方法。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种用于检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的基因元件(CRISPR/Cas9IndelAssaysystem,CIAs)。CIAs基因元件包括有效连接的启动子、第一报告基因、REST基因、SV40pA基因、S沉默子、第二报告基因和终止子，其中，启动子与第一报告基因基因之间可插入被切割目标DNA序列，第一报告基因不同于第二报告基因，REST基因的表达能够抑制沉默子后面第二报告基因的表达。进一步地，基因元件还包括有效连接的增强子。进一步地，增强子为CMV增强子。进一步地，第一报告基因为红色荧光蛋白基因，第二报告基因为绿色荧光蛋白基因。进一步地，启动子为EF1启动子，终止子为β-球蛋白聚腺苷酸。进一步地，基因元件含有双酶切位点，双酶切位点位于启动子和第一报告之间，被切割目标DNA序列连接至双酶切位点之间。进一步地，双酶切位点为XbaI和KpnI酶切位点。进一步地，REST基因和S沉默子扩增于人源H9细胞系。进一步地，基因元件具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。根据本专利技术的另一方面，提供了一种用于检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的载体。该载体包括上述任一种基因元件。进一步地，载体为pUC系列载体、pEASY、pBlueScriptII或pBR322。根据本专利技术的另一方面，提供了一种宿主细胞。该宿主细胞包括上述任一种用于检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的载体。进一步地，宿主细胞为大肠杆菌。根据本专利技术的再一方面，提供了一种检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的方法。该方法为采用上述任一种用于检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的载体进行检测。进一步地，包括以下步骤：S1，将上述任一种载体插入被切割目标DNA序列，然后转染至细胞系中，同时转入装载有gRNA的载体(包含表达Cas9蛋白的DNA序列)；S2，观察第一报告基因和第二报告基因的表达情况，根据第一报告基因和第二报告基因的表达情况判断gRNA对目标DNA序列的编辑是否产生了移码突变。进一步地，还包括：当第二报告基因正常表达时，判断为CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生了移码突变，并扩增目标DNA序列进行测序。进一步地，细胞系为HEK293细胞系。用于检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的基因元件(简称CIAs)可作为核心元件连接到载体中，可以用来在活细胞胞内鉴定gRNA对基因组的切割效率，该检测具有产生移码突变时是即时荧光表现型、高稳定性的荧光表型和易操作性，并且该载体构建具有简单、快速、省时、省力等遗传操作的显著优点。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1示出了基因元件CIAs组成示意图。；图2a和2b分别为本专利技术的基因元件CIAs装载的CIAs-pUC19和pCIAs的质粒图谱。图3a和3b分为装载目的DNA序列的target-pCIAs和target-1-pCIAs。图4a、4b、4c和4d分别为装载gRNA序列的质粒图谱。图5a、5b、5c和5d分别为目的DNA被编辑和没有被编辑的菌株的光镜和荧光照片。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本专利技术。针对现有技术中存在的一些技术问题，本专利技术提供一种检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的基因元件、载体、宿主细胞及方法。根据本专利技术一种典型的实施方式，提供一种用于检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的基因元件。该基因元件包括有效连接的启动子、第一报告基因、REST基因、SV40pA基因、S沉默子、第二报告基因和终止子，其中，启动子与第一报告基因基因之间可插入被切割目标DNA序列，第一报告基因不同于第二报告基因，REST基因的表达能够抑制沉默子后面第二报告基因的表达。本专利技术中的“有效连接”即生物
的常规含义，即连接后的基因元件能够起到其预定的作用。目标DNA序列被连接至上述基因元件中，gRNA/Cas9复合体切割目标DNA序列产生移码突变时，第一报告基因和REST基因也会产生移码突变，是不能表达正确的第一报告基因-REST融合蛋白，即为无法产生第一报告基因的蛋白，也不能抑制S沉默子后面第二报告基因的表达。这时，第二报告基因的蛋白是能够正常表达的，可使宿主细胞系产生第二报告基因的信号。目标DNA序列被连接至基因元件CIAs中，gRNA/Cas9复合体切割目标DNA序列不产生移码突变时，第一报告基因和REST基因表达正确的第一报告基因-REST融合蛋白，即为产生第一报告基因的蛋白，同时S沉默子抑制后面第二报告基因的表达。这时，第一报告基因是能够正常表达的，而第二报告基因是不表达的，所以第一报告基因的信号。当第一报告基因为红色荧光蛋白基因，第二报告基因为绿色荧光蛋白基因时，目标DNA序列被连接至基因元件CIAs中，gRNA/Cas9复合体切割目标DNA序列产生移码突变时，基因元件红色荧光蛋白和REST本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的基因元件，其特征在于，所述基因元件包括有效连接的启动子、第一报告基因、REST基因、SV40pA基因、S沉默子、第二报告基因和终止子，其中，所述启动子与第一报告基因基因之间可插入被切割目标DNA序列，所述第一报告基因不同于所述第二报告基因，所述REST基因的表达能够抑制所述S沉默子后面第二报告基因的表达。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测CRISPR/Cas9基因编辑系统切割基因产生移码突变的基因元件，其特征在于，所述基因元件包括有效连接的启动子、第一报告基因、REST基因、SV40pA基因、S沉默子、第二报告基因和终止子，其中，所述启动子与第一报告基因基因之间可插入被切割目标DNA序列，所述第一报告基因不同于所述第二报告基因，所述REST基因的表达能够抑制所述S沉默子后面第二报告基因的表达。2.根据权利要求1所述的基因元件，其特征在于，所述基因元件还包括有效连接的增强子。3.根据权利要求2所述的基因元件，其特征在于，所述增强子为CMV增强子。4.根据权利要求1所述的基因元件，其特征在于，所述第一报告基因为红色荧光蛋白基因，所述第二报告基因为绿色荧光蛋白基因。5.根据权利要求1所述的基因元件，其特征在于，所述启动子为EF1启动子，所述终止子为β-球蛋白聚腺苷酸。6.根据权利要求1所述的基因元件，其特征在于，所述基因元件含有双酶切位点，所述双酶切位点位于所述启动子和所述第一报告之间，所述被切割目标DNA序列可连接至所述双酶切位点之间。7.根据权利要求6所述的基因元件，其特征在于，所述双酶切位点为XbaI和KpnI酶切位点。8.根据权利要求1所述的基因元件，其特征在于，所述REST基因和所述S沉默子扩增于人源H9细胞系。9.根据权利要求1所述的基因元件，其特征在于，所述基因元件具有如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。10.一种用于检测CRISPR/Cas9基因编辑...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁文静，兰峰，张治宇，
申请(专利权)人：北京赛贝生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11