神经干细胞诱导分化培养基及神经干细胞诱导分化的方法技术

本发明专利技术公开了一种神经干细胞诱导分化培养基及神经干细胞诱导分化的方法。其中，该神经干细胞诱导分化培养基包括基础培养基和添加剂；其中，基础培养基为DMEM/F12培养基；添加剂包括谷氨酰胺1～5mM，GSK‑3抑制剂2～8μM，BMP抑制剂2～10μM，ALK抑制剂2～10μM，细胞培养添加剂0.5％～2％和双抗0.5％～2％。本发明专利技术的神经干细胞诱导分化培养基成分明确且简单、分化效率高、分化时间短，且不含动物源成分，分化过程中不需要动物源细胞做饲养层，无需形成EB，也不需要多次更换分化中的培养液组分，短时间内可获得大量高纯度的神经干细胞。

Differentiation medium of neural stem cells and methods of inducing differentiation of neural stem cells

The invention discloses a medium for inducing differentiation of neural stem cells and a method for inducing differentiation of neural stem cells. Among them, the medium for inducing differentiation of neural stem cells includes basic medium and additives, among which DMEM/F12 medium is the basic medium; additives include glutamine 1-5mM, GSK_3 inhibitor 2-8um M, BMP inhibitor 2-10um, ALK inhibitor 2-10um, cell culture additive 0.5-2% and double resistance 0.5-2%. The medium for inducing differentiation of neural stem cells in the present invention has clear and simple components, high differentiation efficiency, short differentiation time, no animal-derived components, no animal-derived cells as feeder layer, no need to form EB, and no need to replace the medium components in differentiation for many times, so a large number of high purity neural stem cells can be obtained in a short time.

【技术实现步骤摘要】
神经干细胞诱导分化培养基及神经干细胞诱导分化的方法
本专利技术涉及生物医学
，具体而言，涉及一种神经干细胞诱导分化培养基及神经干细胞诱导分化的方法。
技术介绍
日本学者中山申弥(ShinyaYamanaka)于2006年和2007年，首次通过导入四个转录因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)的方法，分别成功将小鼠(TakahashiandYamanaka.,2006)和人(Takahashietal.,2007)的皮肤成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞(InducedPluripotentStemCells,iPSCs)，并因此获得了2012年的诺贝尔医学和生理学奖。hiPS细胞(人诱导多能干细胞)具备hES细胞(人胚胎干细胞)的所有分化能力，并且没有伦理问题，在不久的将来会完全取代hES细胞，成为再生医学的最主要细胞来源。神经科学研究包括其发育，分化以及退化的全过程，涉及结构与发育生物学，神经兴奋与突触传导，神经退行性疾病研究等。神经干细胞(neuralstemcell，NSCs)是一类具有分裂潜能和自我更新能力的母细胞，它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞(神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞等)，神经干细胞在神经发育和修复受损神经组织中发挥重要作用。目前神经退行性疾病如帕金森病、阿尔兹海默等均是由于神经细胞的病变而引起，目前再生医学为这些疾病带来希望，因此需要大量的神经元等神经干细胞来源细胞解决研究中的细胞来源问题。常见的iPSCs诱导神经分化有拟胚体(EmbryoidBodies,EBs)法、基质细胞共培养法和单层细胞诱导法。其中，拟胚体(EmbryoidBodies,EBs)法：当hiPSCs在悬浮培养中分化，形成一个三维的细胞聚合体时称之为拟胚体(embryoidbody，EB)。EB形成以后，可以定向诱导其向神经系统分化。当进一步分化之后，EB形成了一个多层结构，这种多层结构包括多种混合型细胞，其中包括神经细胞。为了增强其神经分化并且提高所需细胞的存活率，通常需要在培养基中添加生长因子及成形素。最近，Koch等专利技术了一种方法，该方法使用由hESC短期培养产生的EB在贴壁条件下直接分化，可以完成由hESC逐步分化成人类神经前体细胞。另外，有人专利技术了一种液-固界面交替的培养系统来产生同种均一的人类神经前体细胞。这种方法实现了三维立体并且形成了紧密相连的神经组织。当神经前体细胞诱导形成之后，再根据需要将分化成的神经前体细胞用特定的神经细胞培养基(添加有不同神经细胞生长因子)进一步分化成所需的神经细胞。该方法的局限性在于：1)形成EB的变异性(由于初始不同的细胞数目或者分化所持续时间)影响了人类神经前体细胞产生的数量；2)存在于EB不同层的成形素，其浓度的不均一性形成了一个浓度梯度，导致了不同胚层组织不同发展阶段的细胞产生；3)在神经分化过程中，EBs中聚集的细胞阻碍对细胞形态学的监控。基质细胞共培养法：基质细胞通过分泌细胞因子，促进培养体系中目的细胞的生长。为了促进hiPSCs向神经细胞分化，将hiPSCs与PA6或MS5基质细胞共培养，这些基质细胞分泌或者表达出还未完全被鉴定的因子，这些因子能促进神经玫瑰花样结构的形成，并且被称之为“基质细胞来源的诱导性活力分子”(SDIA)，这种共培养方法的理论基础是中胚层的信号有助于神经分化。虽然这项技术有效的促进了hESC分化成神经细胞，但这种模型不适宜细致分析这种驱动其向神经分化的分子机制，因为由那些基质细胞分泌的因子是随基质细胞种类变化而变化的。单层细胞诱导法：在胚胎形成过程中，神经胚形成是器官形成的开端，外胚层的形成可以通过不改变饲养层细胞而延长hiPSCs的培养时间来实现。事实上，在无血清和成形素培养条件下，hiPSCs是可以分化成同种均一类型的神经上皮细胞的，这些神经上皮细胞形成玫瑰花样的结构，它们具有神经管的细胞分子结构。此分化过程大致需要2周，与人类胚胎发育过程中神经管的形成在所需时间上是一致的。但是在玫瑰花样阶段，细胞容易形成中枢或周围神经系统。随着体外培养时间的延长，多向分化潜能的缺失，神经分化也会停止。应用这种方法所获得的细胞在很大程度上是不均一的。因此需要改进培养条件来促进细胞分化成均一的神经前体细胞。上述分化方法中，单层细胞诱导法与基质细胞共培养法均存在分化不均一、成分不纯净等缺点，因此目前绝大部分分化方法是模拟体内发育过程分步诱导(EB法)。以其中一篇文献为例，培养多潜能干细胞用的是20％KOSR加入到DMEM/F12基础培养基，再添加谷氨酸、bFGF、非必须氨基酸(NEAA)等。分化时，先将干细胞传代，在低贴附的培养皿内悬浮培养形成拟胚体(EB)，此时用DMEM/F12添加ITS培养，第4天将EB贴附到基质胶包被的培养板中，形成rosette后手动分离或者传代，期间加入Noggin和SB421542，分化到第14天得到神经干细胞。现有技术中部分多潜能干细胞仍然使用明胶包被和饲养层细胞(小鼠胚胎成纤维细胞，mouseembryonicfibroblasts,MEF)的支持，还采用成分复杂的敲除血清替代品(KnockoutSerumReplacement,KOSR)作为主要的培养基添加剂，这限制了细胞产品的后续应用。此外，EB成分复杂，在分化过程中产生不同种类的杂细胞，且很难纯化到高纯度的目的细胞；且这些分化方法使用不同的添加剂，使得分化成本较高，不利于大批量制备。另外，传统分化方法周期教长，进一步阻碍了目的细胞的获得。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种神经干细胞诱导分化培养基及神经干细胞诱导分化的方法，以解决现有技术中神经干细胞诱导分化成本高、周期长且不稳定的而技术问题。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种神经干细胞诱导分化培养基。该神经干细胞诱导分化培养基包括基础培养基和添加剂；其中，基础培养基为DMEM/F12培养基；添加剂包括谷氨酰胺1～5mM，GSK-3抑制剂2～8μM，BMP抑制剂2～10μM，ALK抑制剂2～10μM，细胞培养添加剂0.5％～2％和双抗0.5％～2％。进一步地，添加剂包括谷氨酰胺2～4mM，GSK-3抑制剂3～6μM，BMP抑制剂2～8μM，ALK抑制剂2～10μM，细胞培养添加剂0.5％～2％和双抗1％。进一步地，添加剂包括谷氨酰胺3mM，GSK-3抑制剂4μM，BMP抑制剂5μM，ALK抑制剂5μM，细胞培养添加剂1％和双抗1％。进一步地，GSK-3抑制剂为CHIR99021，BMP抑制剂为DMH1，ALK抑制剂为SB431542，细胞培养添加剂为B27，双抗为青霉素和链霉素。进一步地，基础培养基保存在4～8℃，添加剂保存在-20～-80℃冰冻保存。进一步地，神经干细胞诱导分化培养基在使用前配制，具体包括以下步骤：在2～8℃化冻添加剂；将添加剂与基础培养基以1：50的体积混合后形成神经干细胞诱导分化培养基。进一步地，神经干细胞诱导分化培养基在使用前0～14天配制，并在2～8℃保存。根据本专利技术的另一方面，提供了一种神经干细胞诱导分化的方法。该方法包括采用上述神经干细胞诱导分化培养基培养。进一步地，包括以下步骤：S1，接种诱导多能干细胞或胚胎干细胞于基质胶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种神经干细胞诱导分化培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加剂；其中，所述基础培养基为DMEM/F12培养基；所述添加剂包括谷氨酰胺1～5mM，GSK‑3抑制剂2～8μM，BMP抑制剂2～10μM，ALK抑制剂2～10μM，细胞培养添加剂0.5％～2％和双抗0.5％～2％。

【技术特征摘要】
1.一种神经干细胞诱导分化培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加剂；其中，所述基础培养基为DMEM/F12培养基；所述添加剂包括谷氨酰胺1～5mM，GSK-3抑制剂2～8μM，BMP抑制剂2～10μM，ALK抑制剂2～10μM，细胞培养添加剂0.5％～2％和双抗0.5％～2％。2.根据权利要求1所述的神经干细胞诱导分化培养基，其特征在于，所述添加剂包括谷氨酰胺2～4mM，GSK-3抑制剂3～6μM，BMP抑制剂2～8μM，ALK抑制剂2～10μM，细胞培养添加剂0.5％～2％和双抗1％。3.根据权利要求2所述的神经干细胞诱导分化培养基，其特征在于，所述添加剂包括谷氨酰胺3mM，GSK-3抑制剂4μM，BMP抑制剂5μM，ALK抑制剂5μM，细胞培养添加剂1％和双抗1％。4.根据权利要求1所述的神经干细胞诱导分化培养基，其特征在于，所述GSK-3抑制剂为CHIR99021，所述BMP抑制剂为DMH1、LDN-212854或者ML347，所述ALK抑制剂为SB431542、GW788388或者RepSox，所述细胞培养添加剂为B27，所述双抗为青霉素和链霉素。5.根据权利要求1所述的神经干细胞诱导分化培养基，其特征在于，所述基础培养基保存在4～8℃，所述添加剂保存在-20～-80℃冰冻保存。6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：鲁文静，兰峰，
申请(专利权)人：北京赛贝生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11