一种三环岩兰烯用于促进神经干细胞增殖的用途制造技术

本发明专利技术公开了一种三环岩兰烯用于促进神经干细胞增殖的用途。神经干细胞(NSCs)是一类能够自我更新、增殖和分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的细胞。NSCs的发现为治疗神经系统疾病、神经系统损伤和脑部肿瘤等带来新希望。据文献报道，成体动物脑中NSCs数量较少且大部分处于静息状态，而体外培养的NSCs增殖能力亦有限，因此如何有效促进NSCs的增殖是目前急需解决的科研问题之一。本发明专利技术发现，三环岩兰烯可以有效促进神经干细胞的增殖，且不会影响其干性和分化能力，三环岩兰烯可以用作添加剂制备促进神经干细胞增殖的药物和培养基。

【技术实现步骤摘要】
一种三环岩兰烯用于促进神经干细胞增殖的用途
本专利技术属于生物干细胞领域，涉及一种三环岩兰烯用于促进神经干细胞增殖的用途。
技术介绍
神经干细胞(NSCs)是一类能够自我更新、增殖和分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的细胞。NSCs的发现为治疗神经系统疾病、神经系统损伤和脑部肿瘤等带来新希望。据文献报道，成体动物脑中NSCs数量较少且大部分处于静息状态，而体外培养的NSCs增殖能力亦有限，因此如何有效促进NSCs的增殖是目前急需解决的科研问题之一。三环岩兰烯为一种天然化合物，其化学结构如下。目前，尚未见三环岩兰烯可以促进神经干细胞增殖的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种三环岩兰烯用于促进神经干细胞增殖的用途。本专利技术的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：三环岩兰烯在制备促进神经干细胞增殖的药物中的应用。三环岩兰烯在制备促进神经干细胞增殖的增殖的培养基中的应用。一种促进神经干细胞增殖的培养基，含有有效浓度的三环岩兰烯。本专利技术发现，三环岩兰烯可以有效促进神经干细胞的增殖，且不会影响其干性和分化能力，三环岩兰烯可以用作添加剂制备促进神经干细胞增殖的药物和培养基。附图说明图1为各组450nm测定吸光度；图2为各组NestinmRNA含量的RT-PCR测定图。具体实施方式下面结合附图和实施例具体介绍本专利技术实质性内容，但并不以此限定本专利技术的保护范围。一、实验材料DMEM/F12培养基、胎牛血清、B27、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子购自美国Gibco公司。三环岩兰烯为中国药科大学生药学实验室赠送，纯度大于98％。细胞计数试剂盒(CCK-8)购自日本株式会社同仁化学研究所。RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit试剂盒、PCRMasterMixKit试剂盒购自Thermo公司。二、实验方法1、神经干细胞的分离与培养取新生2d内的乳鼠，浸泡在体积分数为75％乙醇中5min，取出乳鼠，将其固定在手术台上，用手术剪和镊子取出海马区，PBS清洗后，用镊子将海马区置于含有PBS的EP管内，用剪刀将海马区剪成糜糊状，离心、弃上清，加入胰酶消化15min，加入DMEM/F12培养基终止消化，再次离心、弃上清，加入完全培养基(DMEM/F12+2％B27+0.2μg/L表皮生长因子+0.2μg/L碱性成纤维细胞生长因子+1％P/S)，过筛网，并用针棒研磨，取出含有细胞的完全培养基后，再次离心。弃掉上清后，加入完全培养基，调整细胞密度为5×105个/mL接种到细胞培养皿，置37℃，5％CO2培养箱中培养，收集培养5～7d左右的由数十个或数百个细胞组成的神经球，800r/min离心5min后弃上清，加入新鲜完全培养基，用枪头轻柔、反复多次吹打成单细胞悬液，再次离心、重悬，接种到新培养皿或培养瓶中，记为第1代，每2～3d半量换液一次，约6～8d传代一次。2、分组及干预取第5代神经干细胞，按如下组别进行分组干预：对照组：使用完全培养基培养；三环岩兰烯组：使用含有20μM三环岩兰烯的完全培养基培养。3、细胞增殖活力测定取第5代神经干细胞，消化制成细胞悬液，以3.5×103/孔接种于96孔培养板上，培养于完全培养基中，37℃，5％CO2培养24h后，按照上述分组及干预方法更换培养基继续培养24h；培养结束后，每孔加入细胞计数试剂盒中的CCK-8溶液10μL，在细胞培养箱内继续孵育2h后，分别用酶标仪在450nm测定吸光度，每组实验重复3次。4、神经干细胞的干性测定神经干细胞的干性指神经干细胞的干细胞特性，维持干细胞特性的干细胞才具有优异的分化能力。神经巢蛋白Nestin是神经干细胞的特异性标志抗原，属于中间丝蛋白，目前被广泛用于神经干细胞的鉴定和干性测定。RT-PCR测定神经干细胞中NestinmRNA含量：取第5代神经干细胞，消化制成细胞悬液，以5×104个/cm2细胞数接种于培养瓶中，培养于完全培养基中，37℃、5％CO2培养24h后，按照上述分组及干预方法更换培养基继续培养24h；培养结束后，弃培养基洗涤，收集细胞，采用TRIzol一步法提取总RNA，紫外分光光度计检测浓度，并用1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，逆转录为cDNA。cDNA合成：①将总RNA3μg，Olige(dT)18primer1μL加入EP管内，然后加nuclease-freeWater至12μL。根据说明书，在65℃孵育5min，冰上冷却。②再加入4μL5×ReactionBuffer，1μLRiboLockRNaseInhibitor(20U/μL)，2μL10mmol/LdNTPMix，1μLRevertAidM-MuLVRT(200U/μL)，总体积至20μL，轻轻混匀，然后42℃孵育60min，最后70℃加热5min终止反应。③加入Nestin和内参GAPDH引物，按下列反应体系分别进行PCR扩增：25μLDreamTaqTMGreenPCRMasterMix(2X)，1.5μLForwardprimer，1.5μLReverseprimer，2μLTemplateDNA，20μLnucleasefreeWater，总体积为50μL。以上步骤在冰上操作。④然后在95℃预变性2min，1个循环；95℃变性，30s，Nestin和GAPDH的退火温度分别为54℃和53℃，各30s，72℃延伸，1min，35个循环；最后延伸10min，1个循环。用ImageJ图像分析软件对条带进行吸光度扫描。实时荧光RT-PCR的引物序列：Nestin上游：5’-CAGCCCGCACGAATAATAC-3’Nestin下游：5’-GACTCCCACTGCCTAGCTA-3’GAPDH上游：5’-TATCGGACGCCTGGTTAC-3’GAPDH下游：5’-CTGTGCCGTTGAACTTGC-3’5、数据处理采用均数±标准差表示，用SPSS17.0统计软件包进行t检验，P＜0.05为有显著性差异。三、实验结果1、三环岩兰烯对神经干细胞增殖能力的影响实验结果如表1和图1所示，结果可见，三环岩兰烯可以显著促进神经干细胞的增殖，差异具有统计学意义(P＜0.05)。表1各组450nm测定吸光度(OD450)组别OD450对照组0.4325±0.026三环岩兰烯组0.7415±0.0232、三环岩兰烯对神经干细胞分化能力的影响实验结果如图2所示，结果可见，各组神经干细胞均具有优异的神经干细胞干性，三环岩兰烯不会影响神经干细胞的干性和分化能力。综上可见，三环岩兰烯可以有效促进神经干细胞的增殖，且不会影响其干性和分化能力，三环岩兰烯可以用作添加剂制备促进神经干细胞增殖的药物和培养基。上述实施例的作用在于具体介绍本专利技术的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本专利技术的保护范围局限于该具体实施例。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.三环岩兰烯在制备促进神经干细胞增殖的药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.三环岩兰烯在制备促进神经干细胞增殖的药物中的应用。2.三环岩兰烯在制备促进神经干细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵立士，陈名星，
申请(专利权)人：淮安康宜莱干细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32