一种MMP-9激动剂在促进骨髓间充质干细胞迁移方面的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种MMP‑9激动剂在促进骨髓间充质干细胞迁移方面的应用。本发明专利技术发现，吡唑啉酮衍生物1～5为MMP‑9激活剂，可有效激活骨髓间充质干细胞MMP‑9表达；MMP‑9激活剂吡唑啉酮衍生物1～5可以显著提高骨髓间充质干细胞的体外迁移能力，且迁移促进能力与对MMP‑9的激活强度呈正相关。

【技术实现步骤摘要】
一种MMP-9激动剂在促进骨髓间充质干细胞迁移方面的应用
本专利技术属于生物医药领域，涉及骨髓间充质干细胞的迁移，具体涉及一种MMP-9激动剂在促进骨髓间充质干细胞迁移方面的应用。
技术介绍
脐带间充质干细胞或骨髓间充质干细胞移植可修复或替换受损的细胞，为临床很多难治性疾病的治疗带来了希望。但间充质干细胞移植后向靶组织迁移率低限制了其疗效。近年来研究发现，移植前对脐带间充质干细胞或骨髓间充质干细胞进行预处理可以促进间充质干细胞迁移。目前常用的预处理方法主要有低氧、营养因子和小分子药物等。相对于低氧和营养因子，采用临床上广泛使用的小分子药物更可行。但是，目前临床上可以用于对间充质干细胞进行预处理促进其迁移的小分子药物非常有限，临床选择余地窄，某种程度限制了间充质干细胞移植的疗效。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种MMP-9激动剂在促进骨髓间充质干细胞迁移方面的应用。本专利技术的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：如下化学结构的吡唑啉酮衍生物用作MMP-9激动剂的用途。上述吡唑啉酮衍生物用于制备促进骨髓间充质干细胞迁移的药物的用途。一种促进骨髓间充质干细胞迁移的药物制剂，含有上述的吡唑啉酮衍生物，还含有药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。优选地，所述药学上可以接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。优选地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。如下化学结构的吡唑啉酮衍生物用作MMP-9激动剂的用途。上述吡唑啉酮衍生物用于制备促进骨髓间充质干细胞迁移的药物的用途。一种促进骨髓间充质干细胞迁移的药物制剂，含有上述吡唑啉酮衍生物，还含有药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。优选地，所述药学上可以接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。优选地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。有益效果：本专利技术发现，吡唑啉酮衍生物1～5为MMP-9激活剂，可有效激活骨髓间充质干细胞MMP-9表达；MMP-9激活剂吡唑啉酮衍生物1～5可以显著提高骨髓间充质干细胞的体外迁移能力，且迁移促进能力与对MMP-9的激活强度呈正相关。附图说明图1为吡唑啉酮衍生物1～5对骨髓间充质干细胞中MMP-9表达水平的影响；图2为吡唑啉酮衍生物1～5对骨髓间充质干细胞迁移能力的影响(Transwell迁移实验)；图3为吡唑啉酮衍生物1～5对骨髓间充质干细胞迁移能力的影响(细胞划痕实验)。具体实施方式下面结合附图和实施例具体介绍本专利技术实质性内容，但并不以此限定本专利技术的保护范围。一、实验材料吡唑啉酮衍生物1～5的化学结构如下所示，按照文献方法制备(王文琛等，吡咯酰胺催化合成吡唑啉酮衍生物，合成化学，2018年05期)。胎牛血清购自Gibco公司，IMDM培养基购自HyClone公司，Transwell小室购自美国Corning公司，兔抗鼠MMP-9购自美国Millipore公司。二、实验方法1、骨髓间充质干细胞的培养颈椎脱臼法处死3周龄健康雄性SD大鼠，置于体积分数为75％乙醇中浸泡5min后，无菌条件下分离出四肢的股骨及肱骨，并放入缓冲液(含青霉素-链霉素)中浸洗3次，去除长骨的骨骺端，用含10％胎牛血清的IMDM培养基反复冲洗骨髓腔，并将含骨髓细胞的培养基加入15mL离心管中，室温离心，弃上清液，加入含10％胎牛血清的IMDM培养基，均匀接种于25mL培养瓶，置入37℃、体积分数为5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中，48h后首次换液，弃除不贴壁的悬浮细胞，此后每48h换液1次。待贴壁细胞长至80％～90％融合时，胰酶消化，以1:2的比例传代，培养至第3代备用。2、westernblot测定骨髓间充质干细胞中MMP-9的表达水平消化收集第3代骨髓间充质干细胞，以1×105/孔(500μL)接种在24孔细胞培养板中，置于37℃、体积分数为5％CO2细胞培养箱培养，接种24h细胞贴壁生长后，全部培养孔内的细胞换液，PBS洗3遍，对照组继续使用含体积分数为10％胎牛血清的IMDM培养基(500μL)培养，给药组加入含10μM药物、10％胎牛血清的IMDM(500μL)培养。培养48h后，消化收集细胞，加入蛋白裂解液，置于冰上60min并定期震荡。4℃12000r/min离心15min，取上清，BCA法测定蛋白浓度。根据SDS-PAGE凝胶配制试剂盒说明书配胶，进行电泳，转膜，封闭，加入兔抗鼠MMP-9一抗(1:500)，在4℃冰箱过夜；洗膜后加入二抗(1:2000)，室温放置2h，洗膜3～5次，置于ECL发光剂中，显影，定影，蒸馏水冲洗终止，凝胶图像处理系统分析结果。内参使用β-actin，以MMP-9/β-actin灰度比值为统计量。3、Transwell小室实验观察药物对骨髓间充质干细胞迁移的影响用0.25％胰酶消化第3代骨髓间充质干细胞，置于37℃培养箱5min，加入含体积分数为10％胎牛血清的IMDM培养基终止消化，收集细胞至离心管，300×g离心5min，弃尽上清液，用PBS重悬细胞，调整细胞浓度为1×109/L，收集105个细胞加入离心管，300×g离心5min，使用100μL培养基重悬细胞加入Transwell上室，对照组采用IMDM培养基，给药组采用含10μM药物的IMDM培养基，下室加入含10％胎牛血清的IMDM培养基600μL，使上室完全浸泡在下室培养基里，吸引上室细胞穿越滤膜到达下室，操作时注意勿留气泡影响细胞迁移，于37℃、体积分数为5％CO2细胞培养箱培养48h后取出Transwell小室，弃尽上、下室的液体，PBS洗涤3遍，40g/L多聚甲醛固定30min，PBS洗涤2遍，结晶紫染色液染15min，PBS洗2遍，用棉球擦去上室未迁移的细胞，高倍显微镜下计数，每组取10个视野观察计算平均值，穿越滤膜的细胞数越多表明细胞迁移能力越强。4、细胞划痕实验观察药物对骨髓间充质干细胞迁移的影响将第3代骨髓间充质干细胞以2×105个/孔接种至6孔培养板，置于37℃、5％CO2细胞培养箱培养，待细胞生长至70％～80％密度时，用含体积分数为1％胎牛血清的IMDM培养基饥饿过夜，使细胞停止生长，次日用无菌10μL枪头在培养板的底部均匀划一条直线，使底部贴壁细胞形成一条“裸露”区域，PBS洗涤3遍移去漂浮细胞，对照组添加含10％胎牛血清的IMDM培养基，给药组添加含10μM药物、10％胎牛血清的IMDM培养基，分别在划痕12h在显微镜下拍照。采集的图片使用Image-proPlus5.0计算各时间点细胞未覆盖的面积。迁移至划痕区的细胞数越多证明细胞迁移能力越强。细胞迁移率(％)＝(1-培养后划痕距离/划痕初始距离)×100％。5、统计学方法使用SPSS17.0统计软件进行统计学处理。计量资料数据用均值±标准偏差表示，P<0.05为差异有显著性意义。三、实验结果1、药物对骨髓间充质干细胞中MMP-9表达水平的影响结果如表1和图1所示。与对照组相比，各给药组MMP-9表达水平均显著上调，差异具有统计学意义(P＜0.05)。该结果表明，吡唑啉酮衍生物1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.如下化学结构的吡唑啉酮衍生物用作MMP‑9激动剂的用途。

【技术特征摘要】
1.如下化学结构的吡唑啉酮衍生物用作MMP-9激动剂的用途。。2.权利要求1所述吡唑啉酮衍生物用于制备促进骨髓间充质干细胞迁移的药物的用途。3.一种促进骨髓间充质干细胞迁移的药物制剂，其特征在于：含有权利要求1所述的吡唑啉酮衍生物，还含有药学上可以接受的载体或赋形剂，制...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵立士，陈名星，
申请(专利权)人：淮安康宜莱干细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32