一种miR-99a-5p表达促进剂在骨髓间充质干细胞分化中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种miR‑99a‑5p表达促进剂在骨髓间充质干细胞分化中的应用。骨髓间充质干细胞是来源于中胚层的一类干细胞，其在体外具有多方向分化潜能，存在于骨髓内并具有明显贴壁能力，可分化为成骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞等多种细胞，其在骨代谢调节中起着较为关键的作用。本发明专利技术发现，甘松香酮E、甘松香酮D、甘松香酮B、山尖菜内酯为miR‑99a‑5p的表达促进剂，该四种miR‑99a‑5p表达促进剂可以有效促进骨髓间充质干细胞成骨分化，现有技术没有报道过本发明专利技术技术方案，也不存在技术启示。

【技术实现步骤摘要】
一种miR-99a-5p表达促进剂在骨髓间充质干细胞分化中的应用
本专利技术属于生物领域，涉及骨髓间充质干细胞的分化调控，具体涉及一种miR-99a-5p表达促进剂在骨髓间充质干细胞分化中的应用。
技术介绍
因创伤、肿瘤、骨质疏松等造成的骨不连、骨缺损等一直是骨科医师需要解决的难题，骨组织工程学的长足发展有望在未来攻克这一问题。任何组织工程骨构建均由种子细胞、培养环境与支架材料组成。骨髓间充质干细胞是来源于中胚层的一类干细胞，其在体外具有多方向分化潜能，存在于骨髓内并具有明显贴壁能力，可分化为成骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞等多种细胞，其在骨代谢调节中起着较为关键的作用。机体增加骨量和维持骨量的细胞来源主要为骨髓间充质干细胞分化成的成骨细胞，是人体骨骼维持健康的重要因素。骨髓间充质干细胞比较容易获得，体外扩增后仍无免疫原性，且易转染外源性基因并能长期传代表达。另外，应用骨髓间充质干细胞进行自体移植实验和治疗时几乎不受伦理学限制。体外骨髓间充质干细胞的增殖分化可以受多因素的准确调控，因此它一致被视为移植实验和治疗首选的干细胞。促进骨髓间充质干细胞定向分化的药物研究也从未停滞。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种miR-99a-5p表达促进剂在骨髓间充质干细胞分化中的应用。本专利技术的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：甘松香酮E或甘松香酮D用作miR-99a-5p表达促进剂的用途。甘松香酮E或甘松香酮D用于制备促进间充质干细胞成骨分化的药物的用途。优选地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。一种促进间充质干细胞成骨分化的药物制剂，含有甘松香酮E或甘松香酮D，还含有药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。优选地，所述药学上可以接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。优选地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。优选地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。甘松香酮B用作miR-99a-5p表达促进剂的用途。甘松香酮B用于制备促进间充质干细胞成骨分化的药物的用途。优选地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。一种促进间充质干细胞成骨分化的药物制剂，含有甘松香酮B，还含有药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。优选地，所述药学上可以接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。优选地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。优选地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。山尖菜内酯用作miR-99a-5p表达促进剂的用途。山尖菜内酯用于制备促进间充质干细胞成骨分化的药物的用途。优选地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。一种促进间充质干细胞成骨分化的药物制剂，含有山尖菜内酯，还含有药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。优选地，所述药学上可以接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。优选地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。优选地，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。有益效果：本专利技术发现，甘松香酮E、甘松香酮D、甘松香酮B、山尖菜内酯为miR-99a-5p的表达促进剂，该四种miR-99a-5p表达促进剂可以有效促进骨髓间充质干细胞成骨分化。附图说明图1为甘松香酮E、甘松香酮D、甘松香酮B、山尖菜内酯化学结构式；图2为各组骨髓间充质干细胞中miR-99a-5p表达水平；图3为各组骨髓间充质干细胞中碱性磷酸酶活性；图4为各组骨髓间充质干细胞中Ⅰ型胶原蛋白浓度；图5为各组骨髓间充质干细胞中骨钙素浓度；图6为各组骨髓间充质干细胞中钙结节数量。具体实施方式下面结合附图和实施例具体介绍本专利技术实质性内容，但并不以此限定本专利技术的保护范围。一、实验材料胎牛血清、IMDM培养基购自美国GIBCO公司，大鼠骨钙素酶联免疫试剂盒、大鼠Ⅰ型胶原蛋白酶联免疫试剂盒购自CUSABIO公司，碱性磷酸酶测试盒购自南京建成公司。甘松香酮E(CAS号：119403-27-9)、甘松香酮D(CAS号：119403-26-8)、甘松香酮B(CAS号：115370-61-1)、山尖菜内酯(CAS号：58879-96-2)购买或自制，纯度不低于98％。化学结构式如图1所示。二、实验方法1、骨髓间充质干细胞的原代分离、培养及传代颈椎脱臼法处死3周龄健康雄性SD大鼠，置于体积分数为75％乙醇中浸泡5min后，无菌条件下分离出四肢的股骨及肱骨，并放入缓冲液(含青霉素-链霉素)中浸洗3次，去除长骨的骨骺端，用含10％胎牛血清的IMDM培养基反复冲洗骨髓腔，并将含骨髓细胞的培养基加入15mL离心管中，室温离心，弃上清液，加入含10％胎牛血清的IMDM培养基，均匀接种于25mL培养瓶，置入37℃、体积分数为5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中，48h后首次换液，弃除不贴壁的悬浮细胞，此后每48h换液1次。待贴壁细胞长至80％～90％融合时，胰酶消化，以1:2的比例传代。2、骨髓间充质干细胞分组及体外诱导分化取第4代骨髓间充质干细胞，消化后调整细胞浓度至1×107/L，接种于25mL培养瓶中，将培养细胞分为对照组、甘松香酮E组、甘松香酮D组、甘松香酮B组、山尖菜内酯组。培养24h后进行定向诱导，对照组加入基础成骨诱导剂(地塞米松1×10-8mol/L、β-甘油磷酸钠1×10-2mol/L、抗坏血酸5×10-2g/L)，甘松香酮E组、甘松香酮D组、甘松香酮B组、山尖菜内酯组在基础成骨诱导剂基础上再添加20μM甘松香酮E、甘松香酮D、甘松香酮B或山尖菜内酯。持续诱导21d，隔天半量换液，7d传代1次。3、RT-PCR测定骨髓间充质干细胞中miR-99a-5p表达水平收集各组成骨诱导7d的细胞，加入Trizol提取细胞总RNA，测定浓度后，用PrimeScripRTMasterMix(反转录试剂盒)，按照500ng/10μl的体系反转录成50μl的cDNA，用SYBRPremixExTaq(荧光定量PCR试剂盒)以20μl体系在ABI7500实时荧光定量PCR仪上检测miR-99a-5p相对表达量。用β-actin基因表达水平作为内参，计算miR-99a-5p/β-actin基因的比值代表miR-99a-5p的相对表达水平，基因表达相对定量计算采用仪器自带软件。miR-99a-5p和β-actin的引物由上海吉玛制药技术有限公司设计合成，序列如下：miR-99a-5p上游引物：5’-TCGCTAGGATGTTGTGTCATCACATCA-3’；miR-99a-5p下游引物：5’-AGCAGACTTTGATGAAGTACCACTGTT-3’；β-actin上游引物：5’-ATATACGCGCAGTCGACTT-3’；β-actin下游引物：5’-TAAATTGACGCGCGTTCAC-3’。4、碱性磷酸酶活性测定将骨髓间充质干细胞以1×107/L细胞浓度接种到培养瓶中，按上述实验分组进行成骨诱导，各组细胞于成骨诱导第7天进行碱性磷酸酶活性测定。吸取各组培养液上清，离心，取上清标本，按照碱性磷酸酶测试盒说明书操作，酶标仪在520nm波长处测定各组样本的吸光度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.甘松香酮E或甘松香酮D用作miR‑99a‑5p表达促进剂的用途。

【技术特征摘要】
1.甘松香酮E或甘松香酮D用作miR-99a-5p表达促进剂的用途。2.甘松香酮E或甘松香酮D用于制备促进间充质干细胞成骨分化的药物的用途。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞。4.一种促进间充质干细胞成骨分化的药物制剂，其特征在于：含有甘松香酮E或甘松香酮D，还含有药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵立士，陈名星，
申请(专利权)人：淮安康宜莱干细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32