一种通过细胞表面标记特异性富集的人牙周膜干细胞亚群及其干性检测方法技术

本发明专利技术提供了一种特异的人牙周膜干细胞亚群及其富集方法。本方法包含牙组织样品的采集运输，牙周膜干细胞的分离，及表达CD18干细胞的富集。本发明专利技术还提供了一种富集的牙周膜干细胞亚群生物学特性的检测方法。包括与干性相关的集落形成能力检测，增殖能力检测，体外成骨分化能力检测，体内成骨分化能力检测。

A subpopulation of human periodontal ligament stem cells enriched by cell surface markers and its dry detection method

The invention provides a specific human periodontal ligament stem cell subpopulation and its enrichment method. This method includes the collection and transportation of dental tissue samples, the isolation of periodontal ligament stem cells, and the enrichment of CD18-expressing stem cells. The invention also provides a method for detecting the biological characteristics of the enriched periodontal ligament stem cell subsets. It includes the detection of colony forming ability, proliferation ability, osteogenic differentiation ability in vitro and osteogenic differentiation ability in vivo.

【技术实现步骤摘要】
一种通过细胞表面标记特异性富集的人牙周膜干细胞亚群及其干性检测方法
本专利技术涉及一种通过细胞表面标记，优选CD18特异性富集的人牙周膜干细胞亚群及其干性检测方法。本专利技术也涉及将通过本专利技术富集的细胞用于再生医学的用途。
技术介绍
牙周膜是一种特殊的结缔组织，连接牙骨质和牙槽骨，对牙组织起支持营养作用，并维护牙组织的稳态，修复受损牙组织。牙周膜中包含异质性的细胞群，可以分化为成牙骨质细胞（Cementoblast），或成骨细胞（Osteoblasts）。申请人在以前的研究中，通过酶消化法从牙周膜中分离获得具有克隆形成和高增殖能力的细胞。这些细胞在体外具有多向分化能力，包括成骨、成软骨、成脂等。当将这些细胞和羟基磷灰石/磷酸三钙（HA/TCP）颗粒混合，移植于裸鼠皮下时，可形成牙骨质/牙周膜样组织。但这些细胞是高度异质性的，是否像骨髓干细胞一样存在严格的层级、谱系目前还不是很清楚。另外，因为缺乏特异的表面标记，不利于细胞的体外分离和鉴定，也影响对其临床功效的研究。因此，通过特异的表面标记提取特定的细胞亚群，不仅对细化研究这些细胞的生物学特性、了解牙周膜干细胞的全貌至关重要，而且对不同细胞亚群是否有不同的临床效果的研究也是非常关键的，有巨大的基础研究和临床意义。所述的细胞表面标记选自CD18，STRO-1，CD106/VCAM-1，CD146/MUC-18，HOP-26，CD49A/整合素β1，SB-10/CD166中的一个或多个。CD18，也称整合素β2亚家族，是细胞粘附分子中的一员，介导细胞与细胞间、细胞与基质间的相互作用。由于CD18在白细胞上显著表达，过去的很多研究都集中于CD18在白细胞粘附、迁移和免疫反应中的作用。但事实上，CD18也在骨髓基质干细胞上表达，且在骨发生过程中发挥关键作用。缺乏CD18的小鼠表现出骨质疏松症的某些特征，包括骨密度降低，小梁骨数目减少，小梁骨厚度减少，骨小梁空间增加等。而通过病毒转染，过表达CD18可促进骨的形成。申请人最近的研究证实，牙周膜细胞也表达CD18，而且CD18可作为一个独特的细胞分选标记，用于富集一种人牙周膜干细胞亚群。
技术实现思路
如上文所述，骨髓基质干细胞也表达CD18。而最近的研究发现，牙周膜细胞和成骨细胞有很多相似的特性，包括在体外形成矿物结节的能力，表达骨相关表面标记物碱性磷酸酶和骨涎蛋白，以及能够响应骨诱导因子如甲状旁腺激素、胰岛素样生长因子1、骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1等。基于这些事实，我们创造性地专利技术了一种通过CD18特异性富集人牙周膜干细胞亚群的方法，大大提高了体外牙周膜干细胞分离和鉴定的效率。更为重要的是，通过该方法富集的牙周膜干细胞亚群有更强的克隆形成能力，更优的成骨分化能力，具有优越的科研和临床应用前景。具体地说，本专利技术是通过如下技术方案实现的：本专利技术提供了一种特异的人牙周膜干细胞亚群的富集方法。本方法包含牙组织样品的采集运输，牙周膜干细胞的分离，及表达CD18细胞的富集。本方法采用了含有多种抗生素组合的采集液收集牙组织样品，包括但不限于青霉素、链霉素、二性霉素B等。该采集液也可用于其它组织样品的采集，如脂肪、脐带、胎盘等，可大大降低样品污染的可能。本方法中青霉素的使用浓度可以是50U/mL，100U/mL，150U/mL，200U/mL，250U/mL，300U/mL。链霉素的使用浓度可以是50μg/mL，100μg/mL，150μg/mL，200μg/mL，250μg/mL，300μg/mL。二性霉素B的使用浓度可以是1μg/mL，2μg/mL，2.5μg/mL3μg/mL，4μg/mL，5μg/mL。本方法中样品的保存运输温度可以是2℃，4℃，6℃，8℃，10℃，15℃，25℃。本方法中样品从采集到开始提取的时间间隔可以是4小时，8小时，12小时，24小时，48小时，72小时，96小时。本方法采用了含有多种消化酶的组合来分离组织样品，获得单个细胞悬液。包括但不限于胶原酶、分散酶、透明质酸酶、胰酶、EDTA等，这些消化酶组合可大大提高细胞的得率。本方法中胶原酶的使用浓度可以是1mg/ml，2mg/ml，3mg/ml，4mg/ml，5mg/ml，6mg/ml，7mg/ml，8mg/ml，9mg/ml，10mg/ml。分散酶的使用浓度可以是1mg/ml，2mg/ml，3mg/ml，4mg/ml，5mg/ml，6mg/ml，7mg/ml，8mg/ml，9mg/ml，10mg/ml。尽管本方法是优选CD18来富集牙周膜干细胞亚群，但本专利技术不限于使用CD18，还可以使用以下一个或多个标记物的组合来富集牙周膜干细胞亚群，包括STRO-1，CD106/VCAM-1，CD146/MUC-18，HOP-26，CD49A/整合素β1，SB-10/CD166。CD18可以使用荧光标记，或磁珠标记。相应的，精确的细胞分离技术包括流式细胞仪分选，或免疫磁珠分选。本专利技术还提供了一种富集的牙周膜干细胞亚群生物学特性的检测方法。包括与干性相关的集落形成能力检测，增殖能力检测，体外成骨分化能力检测，体内成骨分化能力检测。在证实细胞干性和生物学效力方面，本套检测方法的组合是充分和适宜的。本方法通过测定富集细胞中CFU-F（ColonyFormingUnit-Fibroblast）数目，检测CD18阳性干细胞的克隆形成能力。本方法通过BrdU掺入法检测CD18阳性干细胞的体外增殖能力。本方法中CD18阳性干细胞的体外基础培养基可以是α-MEM，DMEM，D/F-12，RPMI-1640等。完全培养基是在基础培养基的基础上，添加胎牛血清、抗坏血酸2-磷酸酯、谷氨酰胺、青霉素、链霉素等。完全培养基中胎牛血清的浓度可以是5%，10%，15%，20%。抗坏血酸2-磷酸酯的浓度可以是50μM，100μM，150μM，200μM。其它添加物浓度是按照本领域公认的优化方案添加。本方案中成骨诱导培养基是在基础培养基的基础上，添加地塞米松，维生素C和β-甘油磷酸钠等。成骨诱导培养基中地塞米松的使用浓度可以是5nM，10nM，15nM，20nM，25nM，30nM。维生素C的使用浓度可以是50μg/mL，100μg/mL，150μg/mL，200μg/mL，250μg/mL，300μg/mL。β-甘油磷酸钠的使用浓度可以是1mM，2mM，3mM，4mM，5mM，6mM，7mM，8mM，9mM，10mM。本方法通过将富集细胞和羟基磷灰石/磷酸三钙（HA/TCP）载体混合，移植于免疫缺陷动物皮下，优选的免疫缺陷动物是裸鼠，通过组织切片来检测细胞的体内分化能力。这一体内移植系统，也是目前本领域公认的金标准。本专利技术富集的CD18阳性干细胞可直接用于再生医学，优选的是牙齿及相关疾病的再生医学。此外，鉴于CD18在骨发生过程中发挥的关键作用，本专利技术也涉及通过各种转基因技术，优选方案是通过逆转录病毒介导的方式，将CD18基因转入各种基质干细胞，包括但不限于牙齿、脂肪、骨髓、脐带、胎盘、脐血等组织来源的基质干细胞，用于骨及相关疾病的再生医学和组织工程。附图说明图1CD18阳性干细胞亚群的表型分析图2CD18阴性干细胞的表型分析对比图3CD18阳性干细胞的集落形成能力分析图4CD18阴本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过细胞表面标记特异性富集的人牙周膜干细胞亚群，其特征在于，所述干细胞为人牙周膜干细胞，所述细胞表面标记选自CD18，STRO‑1，CD106/VCAM‑1，CD146/MUC‑18，HOP‑26，CD49A/整合素β1，SB‑10/CD166中的一个或多个。

【技术特征摘要】
1.一种通过细胞表面标记特异性富集的人牙周膜干细胞亚群，其特征在于，所述干细胞为人牙周膜干细胞，所述细胞表面标记选自CD18，STRO-1，CD106/VCAM-1，CD146/MUC-18，HOP-26，CD49A/整合素β1，SB-10/CD166中的一个或多个。2.权利要求1所述的人牙周膜干细胞亚群，其特征在于，以CD18作为细胞表面标记，所述CD18使用荧光标记或磁珠标记。3.一种权利要求1或2所述人牙周膜干细胞亚群的富集方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：步骤1，收集正常的成人拔除智齿，立即置于4℃预冷的含50-300U/mL青霉素、50-300μg/mL链霉素、和1-5μg/mL二性霉素B的α-MEM培养基中，2℃-8℃条件下运至洁净实验室，所述成人年龄为19到29岁，从收集到开始提取牙周膜干细胞的时间间隔不超过72小时；步骤2，转移至生物安全柜，取出智齿至培养皿，用4℃预冷的无菌磷酸盐缓冲液清洗，即PBS清洗其外表面；步骤3，从牙根表面轻轻剥离残留的牙周膜组织；步骤4，将牙周膜组织置于含1-10mg/mlI型胶原酶和1-10mg/ml分散酶的PBS中，37℃消化1小时；步骤5，将消化液通过70微米的细胞筛过滤，获得含有人牙周膜干细胞的单细胞悬液，900rpm离心5min，用PBS洗细胞一次；步骤6，用PBS重悬细胞，加入CD18单抗，混匀，室温避光孵育30分钟；步骤7，洗涤后，900rpm离心5min，用PBS重悬细胞；步骤8，通过流式细胞仪分选或免疫磁珠分选，获得CD18阳性干细胞亚群。4.一种权利要求1或2所述人牙周膜干细胞亚群的干性检测方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：步骤1，取富集的CD18阳性干细胞亚群，计数；步骤2，900rpm离心5min；步骤3，用含10％-20%胎牛血清、50μM-200μM的抗坏血酸2-磷酸酯、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的α-MEM培养基重悬细胞；步骤4，将104个CD18阳性干细胞接种于T25细胞培养瓶中，置于37℃、5％CO2的孵箱中培养；步骤5，每3-4天换液，14-16天后，倒掉培养液，PBS清洗贴壁细胞，随后用含有0.1%甲苯胺蓝和2%多聚甲醛的PBS溶液进行固定、染色。5.一种权利要求1或2所述人牙周膜干细胞亚群的干性检测方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：步骤1，取富集的CD18阳性干细胞亚群，计数；步骤2，900rpm离心5min；步骤3，用含10％-20%胎牛血清、50μM-200μM的抗坏血酸2-磷酸酯、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的α-MEM培养基重悬细胞；步骤4，...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐随民，
申请(专利权)人：南京泰盛生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32