一种成年大鼠心肌细胞分离方法技术

本发明专利技术提供一种成年大鼠心肌细胞分离方法，包括步骤：（a）预热灌流系统，并充分清洗灌流管道；（b）大鼠腹腔先后注射肝素钠和戊巴比妥钠；（c）迅速打开大鼠胸腔暴露心脏，自主动脉根部取出下心脏置于灌注溶液中，适当清除周围组织后，将主动脉结扎于灌注针上；（d）将插管后的心脏连接灌流系统，无Ca

【技术实现步骤摘要】
一种成年大鼠心肌细胞分离方法
本专利技术属于细胞生物学领域，具体涉及一种成年大鼠心肌细胞分离方法。
技术介绍
心肌细胞(Cardiomyocytes)是不能增殖，获得正常的单个心肌细胞是心肌电生理研究的基础。而大多数研究用的细胞都来自培养的新生鼠心脏，新生鼠的心肌细胞与成年鼠心肌细胞在形态、结构、功能上存在很大的差异，作为心血管研究的生物学实验工具，成年心肌细胞的功能特性是其他发育阶段心肌细胞不可替代的，成熟心肌细胞的体外培养模型是必要的，但成年鼠心肌细胞的培养比较困难。本专利技术所提供得成年大鼠心肌细胞的分离方法可以获得高质量、高产量、存活时间长的成年大鼠心肌细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种获得高质量、高产量、存活时间长的成年大鼠心肌细胞分离的方法。为了解决上述所涉及到的问题，本专利技术采取如下方法获得成年大鼠心肌细胞：成年大鼠心肌细胞分离方法的步骤包括：(a)预热灌流系统，并充分清洗灌流管道；(b)大鼠腹腔先后注射肝素钠和戊巴比妥钠；(c)迅速打开大鼠胸腔暴露心脏，自主动脉根部取出下心脏置于灌注溶液中，适当清除周围组织后，将主动脉结扎于灌注针上；(d)将插管后的心脏连接灌流系统，无Ca2+的灌注溶液灌注心脏；(e)心脏继续灌注混合消化酶液；(f)取下灌注后的心脏置于转移液中，去除心房和大血管去除心房和大血管，将心室剪成小块，吸管吹打使组织成单分散细胞，筛网过滤细胞悬液，静置；(g)梯度复Ca2+；(h)完全培养基重悬复Ca2+后细胞沉淀，接种于包被后的细胞培养瓶中培养。可选的大鼠为体重150-300g，饲养6-8周的SD大鼠。可选的灌注溶液为4℃预冷后的含137mMNaCl2、4mMKCl、1mMMgCl、10mMHEPES、0.33mMNaH2PO4、10mMD-葡萄糖、5mM牛磺酸和10mMBDM缓冲液。可选的无Ca2+的灌注溶液灌注心脏的具体方法为灌流速度为3-5mL/min，灌流时间为2-3min。可选的混合消化酶液为为0.05%-0.1%的胶原酶II、0.05%-0.1%胶原酶IV和0.05%-0.1%蛋白酶混合酶。可选的灌注混合消化酶液的灌流速度为5-10mL/min，灌流时间为25-40min。可选的转移液为含0.05-0.1%BSA的灌注溶液。可选的过滤细胞悬液的筛网为孔径250μm的筛网。可选的梯度复Ca2+的Ca2+终浓度依次为0.06mM、0.24mM、0.6mM和1.0mM；可选的梯度复Ca2+的方法为用含不同Ca2+浓度的溶液重悬细胞沉淀，于37℃沉降10min后，吸弃上清。可选的完全培养基为预热的含5mM肉碱、5mM肌酸、5mM牛磺酸、5%FBS和1%双抗的M199完全培养基。可选的包被细胞培养瓶为0.01-0.015mg/mL层黏连蛋白包被的细胞培养瓶。本专利技术解决了成年大鼠心肌细胞分离过程存活率低及产量少的问题，使获得的成年大鼠心肌细胞产量高、活性高且存活时间长。附图说明图1复Ca2+前的细胞图片100×图2培养24h的细胞图片100×图3培养48h的细胞图片100×图4培养72h的细胞图片100×具体实施方式为了使本专利技术的目的及优势更清新地展现，现将具体实施方式进一步阐述。此处所阐述的具体实施方式仅针对本专利技术进行解释，并不用于限定本专利技术。本实验所用的实验仪器如下：倒置显微镜（XDS-1A，上海），超净工作台（型号：SW-CJ-1FD，苏州超净）；细胞培养箱（型号：240iThermo），超级恒温水浴锅（型号：HH-501型上海创奕科教设备有限公司）、恒流泵（LongerPump，BT100-1L），langendorff灌流系统（北京众实迪创科技发展有限责任公司）。本专利技术选择饲养6-8周，体重为150-300g的SD大鼠，分离成年大鼠心肌细胞。具体操作如下：1、42℃预热灌流系统，先用75%乙灌注清洗10-15min，然后用无菌去离子水清洗10-15min，充分清洗灌流管道；2、实验大鼠于麻醉前20-30min腹腔注射0.2mL的肝素（1000U/mL），然后腹腔注射1%戊巴比妥以麻醉大鼠；3、待麻醉充分后，迅速打开大鼠胸腔暴露心脏，自主动脉根部取出下心脏置于4℃的灌注溶液，适当清除周围组织后，分离出主动脉，用预备好的连在10ml注射器的12号灌流针轻轻插入主动脉，注入约10mL的灌注溶液，以使心脏中部分血液流出，然后用手术线将灌流针固定在主动脉；4、把固定心脏的12号灌流针连接到Langendorff管上，用无Ca2+的灌注溶液灌注心脏，灌流速度为3-5mL/min，灌流时间为2-3min；5、排尽无Ca2+的灌注溶液，用混合酶液灌注心脏至心脏变软，颜色变淡，混合酶液为0.05%-0.1%的胶原酶II、0.05%-0.1%胶原酶IV和0.05%-0.1%蛋白酶，灌流速度为5-10mL/min，灌流时间为25-40min；6、转移灌注后的心脏至转移液中，去除心房和大血管去除心房和大血管，将得到的心室剪成小块，吸管吹打使组织成单分散细胞；7、单分散的细胞悬液经250μm筛网过滤后，镜检，于室温静置10min；8、吸弃上清，加入含有0.06mM、0.24mM、0.6mM和1.0mMCa2+的溶液重悬细胞沉淀，于37℃沉降10min；9、充分吸弃上清，加入预热的含5mM肉碱、5mM肌酸、5mM牛磺酸5%FBS和1%双抗的M199完全培养基重悬细胞沉淀，接种于0.01-0.015mg/mL层黏连蛋白包被后的细胞瓶，置于37℃、5％（m/v）的CO2、饱和湿度的培养箱中培养可达五天。以上已经对本专利技术创造的较佳实施例进行详细阐述，但本专利技术创造不限定于上述实施例，凡在本专利技术的精神和原则之内作出任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本专利技术的保护范围内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种成年大鼠心肌细胞分离及培养方法，其特征在于，包括步骤：（a）预热灌流系统，并充分清洗灌流管道；（b）大鼠腹腔先后注射肝素钠和戊巴比妥钠；（c）迅速打开大鼠胸腔暴露心脏，自主动脉根部取出下心脏置于灌注溶液中，适当清除周围组织后，将主动脉结扎于灌注针上；（d）将插管后的心脏连接灌流系统，无Ca2+的灌注溶液灌注心脏；（e）心脏继续灌注混合消化酶液；（f）取下灌注后的心脏置于转移液中，去除心房和大血管，将心室剪成小块，吸管吹打使组织成单分散细胞，筛网过滤细胞悬液，静置；（g）梯度复Ca2+；（h）完全培养基重悬复Ca2+后细胞沉淀，接种于包被后的细胞培养瓶中培养。

【技术特征摘要】
1.一种成年大鼠心肌细胞分离及培养方法，其特征在于，包括步骤：（a）预热灌流系统，并充分清洗灌流管道；（b）大鼠腹腔先后注射肝素钠和戊巴比妥钠；（c）迅速打开大鼠胸腔暴露心脏，自主动脉根部取出下心脏置于灌注溶液中，适当清除周围组织后，将主动脉结扎于灌注针上；（d）将插管后的心脏连接灌流系统，无Ca2+的灌注溶液灌注心脏；（e）心脏继续灌注混合消化酶液；（f）取下灌注后的心脏置于转移液中，去除心房和大血管，将心室剪成小块，吸管吹打使组织成单分散细胞，筛网过滤细胞悬液，静置；（g）梯度复Ca2+；（h）完全培养基重悬复Ca2+后细胞沉淀，接种于包被后的细胞培养瓶中培养。2.根据权利要求1所述的成年大鼠心肌细胞分离方法，其特征在于，所述的大鼠为体重150-300g，饲养6-8周的SD大鼠。3.根据权利要求1所述的成年大鼠心肌细胞分离方法，其特征在于，所述步骤c中灌注溶液为4℃预冷后的含137mMNaCl2、4mMKCl、1mMMgCl、10mMHEPES、0.33mMNaH2PO4、10mMD-葡萄糖、5mM牛磺酸和10mMBDM缓冲液。4.根据权利要求1所述的成年大鼠心肌细胞分离方法，其特征在于，所述步骤d中无Ca2+的灌注溶液灌注心脏的具体方法为灌流速度为3-5mL/min，灌流时间为...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋敏，齐来俊，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：江苏齐氏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32