一步酶消化法分离提取成年大鼠心肌细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种一步酶消化法分离提取成年大鼠心肌细胞的方法，采用Langendorff灌注装置经主动脉逆行灌流，依次用含钙液、无钙EGTA液、Ⅱ型胶原酶液灌流，收集Ⅱ型胶原酶循环液加入10%BSA溶液，将心室置于其中恒温摇床震荡消化，用吸管吹打循环液至消化完全得消化液，过滤，滤液自然沉降，收集细胞沉淀，悬浮在酶洗脱液中重复沉降即得心肌细胞，该方法获得的大鼠心肌细胞中75-93%都具有活性，每只大鼠心脏的活细胞产量最高可达约（5-8）×108个，本发明专利技术采用单一消化酶分离心肌细胞并用逐步梯度复钙法沉降，既简化了实验步骤，又大大提高了心肌细胞的存活率，简单经济，是分离成年大鼠心肌细胞行之有效的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及细胞的分离和提取
，特别是涉及一种采用。
技术介绍
随着心脏疾病研究的不断发展，心脏离体实验已越来越被人们所重视，尤其是具备正常生理功能的单个心肌细胞已成为研究心脏代谢、功能、病理生理机制的重要基础。目前心肌细胞的提取与培养多采取乳鼠或幼鼠为主，但乳鼠心肌细胞与成熟心肌细胞在功能及结构上都存在不同程度的差异。成年大鼠心肌细胞的分离与培养方法也有多种，灌注酶解法用于成年大鼠的心肌分离已有40余年的历史,但至今仍无统一的方法可循。自Powell等于1976年首先成功分 离出单个钙耐受成熟心室肌细胞以来，迄今为止国内也仅有少数单位初步建立了可用于原代培养的心肌细胞分离方法。究其原因，是因为心肌细胞分离的每一步都会对最终分离的细胞状态产生重要的影响。实验室温度、Langendorff装置设定温度、心脏摘取速度、水质、溶液的PH值、酶的种类、活力及浓度、细胞内外钙浓度变化、操作者的熟练程度等都会影响心肌细胞状态。目前可见的成年大鼠心肌细胞分离与培养方法的报道中，均是采用两种酶混合消化，或者反复的复钙及沉降，这样增加了操作难度和步骤，容易污染，细胞成活率不高。
技术实现思路
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【技术保护点】
一种一步酶消化法分离提取成年大鼠心肌细胞的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）装置预处理：设置Langendorff灌注装置恒温于37℃，消毒，超纯水灌流，预充灌注母液；（2）灌流：将成年大鼠离体心脏挂于Langendorff灌注装置上，经主动脉逆行灌流，设置灌注流量为6？10ml/min，用含钙液灌流1？2min，然后用无钙EGTA液灌流4？5min，再用Ⅱ型胶原酶液单向灌流1.5？2.5min，之后循环灌流10？18min；（3）消化：剪下心室肌组织，弃去心房和大血管，收集Ⅱ型胶原酶循环液，加入10%？BSA溶液至BSA终浓度为8？12mg/ml，取5？10ml，将心室置于其中，37℃、1...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：梁贵友，王峰，汤全，肖志超，蔡庆勇，
申请(专利权)人：遵义医学院附属医院，
类型：发明
国别省市：