本发明专利技术涉及改进的细胞培养方法。具体地，本发明专利技术涉及在反应器中于细胞培养基中于悬浮液中培养细胞，优选E1-永生化的HER细胞，更优选PER.C6细胞的工艺，其中，细胞产生生物物质，优选产生抗体，其中，向细胞培养物补料至少一种细胞培养基组分，并且，其中，包含细胞、生物物质和细胞培养基的细胞培养物在分离系统上循环，并且，其中，所述分离系统将生物物质与比所述生物物质分子量更低的物质分开，并且，其中，所述生物物质保留在反应器中或被回送进反应器。优选地，更低分子量的物质的一部分持续从细胞培养物中移出。
【技术实现步骤摘要】
本申请是中国专利技术专利申请No. 200780026810. 2的分案申请。母案申请日为2007年7月4日，专利技术题目为“”。本专利技术涉及在反应器中于细胞培养基中于悬浮液中培养细胞的工艺。此类工艺例如从W004/099396已知。该文中描述了如何通过优化补料分批工艺中的生长条件来提高细胞培养物的细胞密度和想要的生物材料的产率。此外，W005/095578公开了一种培养细胞的工艺，其通过对包含细胞培养基和细胞的细胞培养物进行连续灌注培养来实现，其中，向细胞培养物中加入细胞培养基，细胞培养物在包含中空纤维的过滤器模块上循环，导致产生比细胞培养物细胞密度更低的液体流出物，并且过滤器模块内部的流是交互切向流(alternating tangential flow),其 中，所述细胞产生生物物质。在W005/095578的实施例中显示，生产了 O. 9g/L/天的产物，这对应于流出物中大约O. 3g/L的产物浓度。含生物物质的液体体积越大，对生物物质的纯化就越费力。W004/099396和W005/095578公开的工艺中，获得的生物物质的浓度并不高。因此，对该生物物质的下游加工是麻烦的，因为需要在应用后续纯化步骤之前对生物物质加以浓缩，或者需要对大体积、低浓度的生物物质加以纯化。因此，以较低的细胞密度培养细胞导致体积生产力(productivity)较低，因此对给定的生产水平需要更大和/或更多的培养容器以及由此需要在装备上投入更多。因此，本专利技术的一个目的是提供一种工艺，其中，以更高的浓度从细胞培养物获得产物。本专利技术的另一目的是使得能够在延长的时间段内培养细胞和生产生物材料。这些目的通过在反应器中于细胞培养基中于悬浮液中培养细胞的如下工艺来实现，其中，所述细胞产生生物物质，其中，向细胞培养物补料至少一种细胞培养基组分，并且，其中，包含细胞、生物物质和细胞培养基的细胞培养物在分离系统上循环，并且，其中，所述分离系统将生物物质与比所述生物物质分子量更低的物质分开，并且，其中，所述生物物质保留在反应器中或被回送进反应器。例如，本专利技术涉及在反应器中于细胞培养基中培养细胞的工艺，其中，所述细胞产生生物物质，其中，向所述反应器补料营养物和/或细胞培养基，并且，其中，包含细胞和细胞培养基的细胞培养物在孔径或分子量分离点在5至500kD之间的过滤器上循环。已经发现，通过使用将生物物质与分子量比生物物质低的物质相分离的分离系统，可以在细胞培养物中以更高浓度积累生物物质。因此，本专利技术不同于现有技术描述的细胞培养，其允许想要的生物材料与细胞物质一起积累。在本专利技术的一种优选的实施方式中，更低分子量的物质的一部分持续从细胞培养物中移出。本专利技术的工艺的另一优点在于，较之例如分批或补料分批工艺，可以达到更高的存活细胞浓度。此外，较之例如分批或补料分批工艺，生产时间(即细胞产生生物物质的时间段)可被延长。此外，较之分批或补料分批工艺，有可能使用更小的反应器。使用更小的反应器是有益的，因为这降低了装备和设施相关的投入。此外，可在更短的时间内获得更高浓度的生物物质。我们发现，可在反应器内获得高浓度的生物物质，而不会显著减少细胞存活性以及因此不需限制生产时间。本领域技术人员将能预计到，将可能发生产物抑制，即，生物物质自身对生物物质生产的抑制，或者细胞产生的其它大分 子(例如，宿主细胞蛋白、酶或细胞残骸)造成的抑制。此外，我们发现，想要的生物材料的积累不会损害分离系统的功能。本专利技术的工艺在细胞密度、细胞培养物中产物浓度以及延长的培养时间等方面，较之根据W005/095578和W004/099396的工艺提供了相当大的好处。由此，本专利技术的工艺导致了对想要的生物材料的改进的生产。可用于生产生物物质的细胞原则上是本领域技术人员已知的能生产生物产物的所有细胞。所述细胞可以是真核的，例如，有丝真菌，例如，Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Trichoderma reesei、Penicillium chrysogenum,酵母，例如Saccharomyces cerevis iae> Kluyveromyces lactis、Phaffia rhodozyma,来自 Pichia属的酵母，例如，Pichia pastoris,或原核的,例如，Escherichia coli、Bacillus sp,例如，B. lichen 和 rmis、B. subtilis、B. amyloliquefaciens>B. alkalophilus、Streptomycessp.、Corynebacterium glutamicum>Pseudomonas sp。真核细胞的例子还例如描述于 Chu,L. , Robinson,D. K.，(2001) Curr. Opinion Biotechn. , vol. 12,p. 180-187 中。优选地，用于本专利技术工艺中的细胞是动物细胞，特别是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞的例子包括CHO (中华仓鼠卵巢)细胞、杂交瘤、BHK(幼仓鼠肾)细胞、骨髓瘤细胞、人细胞(例如HEK-293细胞、人淋巴母细胞)、E1永生化的HER细胞、小鼠细胞(例如NSO细胞)。更优选地，使用El永生化的HER细胞，最优选使用PER. C6细胞。可从胎儿分离初级人胚视网膜(HER)细胞(Byrd P, Brown Kff, GallimorePH.1982.Malignant transformation of human embryo retinoblasts by clonedadenovirus 12 DNA. Nature298 :69-71, Byrd PJ, Grand RJA, Gallimore PH. 1988.Differential transformation of primary human embryo retinal cells by adenovirusElregions and combinations of ElA+ras. 0ncogene2 :477-484)。培养若干传代后，初级细胞将死亡。就本专利技术的目的而言，El永生化的HER细胞得自初级HER细胞，这是通过在其中表达编码腺病毒ElA和ElB蛋白的DNA，来获得永生化细胞的。这类经永生化的细胞可培养超过100次传代。用于获得El永生化HER细胞的方法例如已被描述于美国专利 5，994，128,描述于 Byrd P, Brown Kff, Gallimore PH. 1982Malignant transformationof human embryo retinoblasts by cloned adenovirusl2DNA. Nature298 :69-71,描述于 Byrd PJ, Grand RJA, Gallimore PH. 1988. Differential transformation of primaryhuman embryo retinal cells by adenovirus Elregions and combinations of ElA+ras.0ncogene2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
包含哺乳动物细胞的细胞培养物，其具有至少50×106个细胞/mL的存活细胞密度以及至少5g/L的生物物质浓度。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：格本·梅勒·兹吉尔斯特瑞，罗伯特·帕特里克·浩弗，雅各布·史德勒，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：
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