一种牙鲆胚胎肌卫星细胞系建立方法技术

本发明专利技术涉及海水鱼类胚胎细胞培养技术，具体说是一种牙鲆胚胎期肌卫星细胞系的建立方法。将牙鲆克氏囊形成期的胚胎经过体外分离，去除卵膜，分散细胞，经原代培养和传代培养，继而建立胚胎期肌卫星细胞系。本发明专利技术建立的牙鲆胚胎肌卫星细胞系形态为梭形或者纺锤形单核细胞。单代内如培养超过5天或者进行外源因子(马血清)诱导均能够分化形成肌纤维。该细胞系能提供大量肌卫星细胞，经GFP转染及半滑舌鳎脾肾坏死病毒攻毒实验检测，都可以正常转染或被感染。故其不仅可以直接用于鱼类肌肉生长发育相关功能基因的研究，为探索其肌肉细胞的诱导、增殖及分化的分子机制提供研究材料，而且为牙鲆育种中肌肉性状的改良研究及应用提供平台。

Establishment of a muscle satellite cell line for flounder embryos

The invention relates to a technique for culturing embryonic cells of marine fish, in particular to a method for establishing muscle satellite cell lines of flounder during embryonic stage. The embryos of flounder (Paralichthys olivaceus) at the stage of bursa formation were separated in vitro, the membranes were removed, the cells were dispersed, and the satellite cell lines of embryonic muscle were established after primary culture and passage culture. The muscle satellite cell line of the flounder embryo is spindle shape or spindle shaped monocyte. Muscle fibers can be differentiated in single generation if cultured for more than 5 days or induced by exogenous factors (horse serum). The cell line can provide a large number of muscle satellite cells, which can be transfected or infected normally by GFP transfection and the detection of spleen and kidney necrosis virus of semi-smooth tongue sole. Therefore, it can not only be directly used in the study of functional genes related to muscle growth and development of fish, but also provide research materials for exploring the molecular mechanism of muscle cell induction, proliferation and differentiation, and provide a platform for the research and application of muscle traits in Paralichthys olivaceus breeding.

【技术实现步骤摘要】
一种牙鲆胚胎肌卫星细胞系建立方法
本专利技术涉及海水鱼类胚胎细胞培养技术，具体说是一种牙鲆胚胎期肌卫星细胞系的建立方法。
技术介绍
动物细胞系及细胞培养已经成为生理学、免疫学、病毒学、发育生物学、基因功能以及毒理学等研究必不可少的工具和载体。鱼类养殖业的不断发展，需要对鱼类生长发育、疾病爆发等及其机制开展研究，同时也提出了更前沿生物技术育种技术开发的需求，日益增长的海洋等水环境保护需求也延伸了有关鱼类毒理研究的发展，而这些都将离不开鱼类细胞系平台，故其培养备受重视。自1962年第一个鱼类细胞系建立起，越来越多的鱼类细胞系建立成功并得到应用。胚胎的细胞有别于成体组织，其分化程度低，分裂能力强，多样性高，其应用范围更广，故成为细胞培养的首选。而鱼类胚胎细胞原代细胞培养多数采用饲养层细胞、添加鱼类血清进行培养，以增加细胞生存能力。而鱼类胚体期胚胎细胞系的建立尚未见到报道。有关肌肉肌卫星细胞系，已有报道也都是从幼鱼或者成体肌肉组织分离的，如虹鳟(Jeanetal.，2010)、牙鲆(Pengetal.，2016)，即从鱼类胚胎中分离出肌卫星细胞未见到报道。我们首次从牙鲆胚体期胚胎中分离出肌卫本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牙鲆胚胎肌卫星细胞系，其特征在于：将牙鲆克氏囊形成期的胚胎经过体外分离，去除卵膜，分散细胞，经原代培养和传代培养，继而建立胚胎期肌卫星细胞系。

【技术特征摘要】
1.一种牙鲆胚胎肌卫星细胞系，其特征在于：将牙鲆克氏囊形成期的胚胎经过体外分离，去除卵膜，分散细胞，经原代培养和传代培养，继而建立胚胎期肌卫星细胞系。2.如权利要求1所述的牙鲆胚胎期肌卫星细胞系，其特征在于，经体视镜下取发育到克氏囊形成期的受精卵，用灭菌海水清洗，再经含双抗的PBS清洗，清洗后去除PBS,用灭菌研杵轻轻压破胚胎外膜，使胚胎破膜而出，并轻轻垂直压迫胚胎，使细胞尽量分离，细胞分散后于DF12完全培养基中进行原代培养。3.如权利要求1或2所述的牙鲆胚胎期肌卫星细胞系，其特征在于，所述分散的细胞转移到DF12完全培养基中培养，于25℃下正置培养，待细胞团完成贴壁后补加DF12完全培养基，实现原代培养。4.如权利要求1所述的牙鲆胚胎期肌卫星细胞系，其特征在于，待上述经原代培养的细胞团周围细胞迁出并增殖铺满时，吸弃培养基，经PBS冲洗，加入0.25％的胰蛋白酶消化液消化；待细胞70％变圆，吸弃胰酶，终止消化后加入DF12完全培养基形成悬浮细胞液；而后利用细胞培养基按1:1-1:3(V/V)的比例分瓶传代培养，之后根据细胞汇合度7-...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂苗苗，谭训刚，尤锋，吴志昊，焦爽，肖鹏，娄雅楠，梁冬冬，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37