一种分化培养基及少突胶质前体细胞的制备方法技术

本发明专利技术提供一种用于将神经干细胞分化为少突胶质前体细胞的培养基，该培养基不包含外源因子，避免外源因子的污染并且能够高效分化少突胶质前体细胞；本发明专利技术同时还提供一种利用该培养基制备少突胶质前体细胞的方法，利用本发明专利技术提供的方法能够在提高少突胶质前体细胞产率的前提下提高少突胶质前体细胞的分化效率。

A method for the preparation of differentiated medium and oligodendrocyte precursor cells

The present invention provides a culture medium for differentiating neural stem cells into oligodendrocyte precursor cells, which does not contain exogenous factors, avoids contamination by exogenous factors, and can efficiently differentiate oligodendrocyte precursor cells. The method provided by the invention can improve the differentiation efficiency of oligodendrocyte precursor cells on the premise of improving the yield of oligodendrocyte precursor cells.

【技术实现步骤摘要】
一种分化培养基及少突胶质前体细胞的制备方法
本专利技术涉及细胞分化
，尤其涉及一种培养基及少突胶质前体细胞的制备方法。
技术介绍
髓鞘是神经系统中重要的组成结构，脱髓鞘疾病会导致认知、记忆、运动等功能障碍，严重影响患者的生活质量。髓鞘是由少突胶质细胞(oligodendrocytes,OLs)在脊椎动物中枢神经系统(centralnervoussystem,CNS)中缠绕神经元的轴突而成，在神经发育早期，神经前体细胞先产生神经元，之后开始产生少突胶质前体细胞(oligodendrocyteprecursors,OPs)少突胶质前体细胞向神经系统其他部位迁移、增殖，最后分化为成熟的少突胶质细胞(OLs)并形成髓鞘。目前，体外和体内实验都已经证实少突胶质前体细胞具有增殖、迁移和分化后的成髓鞘能力，因此少突胶质前体细胞移植是治疗髓鞘损伤疾病的一种有效的手段；进来有研究表明，少突胶质前体细胞移植应用研究的的热点在于和髓鞘损伤有关的脊髓损伤的修复。随着多能干细胞研究的深入，少突胶质前体细胞来源的问题得到解决。目前多能干细胞向少突胶质前体细胞的分化主要借鉴和模拟少突胶质细胞在体内的自然发生过程，首先将多能干细胞诱导分化为神经上皮细胞，再进一步分化为少突胶质前体细胞。然而，目前多能干细胞向少突胶质前体细胞分化的步骤复杂冗长，整个培养过程需要4个月左右，长者甚至需要6个月，严重限制了OPs在细胞治疗或构建疾病模型中的应用；目前由神经上皮细胞分化至OPs的培养方法中，培养基中多添加胎牛血清、非人源白蛋白或非人源生长因子等异源物，增加了OPs在临床应用的风险。目前很多学者致力于研究一种能缩短分化时间，提高分化效率的培养基和培养方法。
技术实现思路
为了提高在无外源因子条件下制备少突胶质前体细胞的效率，本专利技术实施例一方面提供一种用于将神经干细胞分化为少突胶质前体细胞的培养基，所述培养基包括由AdvancedDMEM/F12和Neurobasalmedium混合而成的基础培养基，还包括终浓度为0.5～2.5％的GlutaMAX、1～5％的B27、0.5～2.5％的N2、2～25ng/ml的bFGF、2～25ng/ml的PDGF-AA、25～250ng/ml的β-HRG1、1～20μM的2-巯基乙醇以及1％的P/S。本专利技术提供的用于将神经干细胞分化为少突胶质前体细胞的培养基，缩短由神经干细胞分化成少突胶质前体细胞的时间，提高神经干细胞分化为少突胶质前体细胞的分化效率，其中所述培养基中添加2-巯基乙醇不仅能够提高细胞的抗氧化能力，增强细胞活力，并且所述2-巯基乙醇和培养基中的PDGF-AA以及β-HRG1共同作用能显著提高少突胶质前体细胞的分化效率。为了进一步提高少突胶质前体细胞的分化效率及最终成品纯度，优选的是，所述用于将神经干细胞分化为少突胶质前体细胞的培养基中，所述培养基包括由AdvancedDMEM/F12和Neurobasalmedium以体积比为1:1混合而成的基础培养基，还包括终浓度为1％的GlutaMAX、2％的B27、1％的N2、10ng/ml的bFGF、10ng/ml的PDGF-AA、100ng/ml的β-HRG1、10μM的2-巯基乙醇、1％的P/S。进一步优选的是，所述培养基包括由AdvancedDMEM/F12和Neurobasalmedium混合而成的基础培养基，还包括终浓度为0.5～2.5％的GlutaMAX、1～5％的B27、0.5～2.5％的N2、2～25ng/ml的bFGF、2～25ng/ml的PDGF-AA、IGF-1、Wnt3A、25～250ng/ml的β-HRG1、1～20μM的2-巯基乙醇以及1％的P/S。所述培养基中添加IGF-1和Wnt3A能够进一步提高细胞活性，增加少突胶质前体细胞的产量，促进神经干细胞向胶质细胞分化，进一步提高分化效率，其中IGF-1和Wnt3A在培养基中的浓度优选分别为2～25ng/ml和1～10ng/ml。为了进一步提高少突胶质前体细胞的分化效率，增加其产量，所述用于将神经干细胞分化为少突胶质前体细胞的培养基中，所述培养基包括由AdvancedDMEM/F12和Neurobasalmedium以体积比为1:1混合而成的基础培养基，还包括终浓度为1％的GlutaMAX、2％的B27、1％的N2、10ng/ml的bFGF、10ng/ml的PDGF-AA、10ng/ml的IGF-1、5ng/ml的Wnt3A、100ng/ml的β-HRG1、10μM的2-巯基乙醇和1％的P/S。本专利技术实施例另一方面提供了一种制备少突胶质前体细胞的方法，所述方法包括以下步骤：配置包括由AdvancedDMEM/F12和Neurobasalmedium混合而成的基础培养基，并且还包括终浓度为0.5～2.5％的GlutaMAX、1～5％的B27、0.5～2.5％的N2、2～25ng/ml的bFGF、2～25ng/ml的PDGF-AA、25～250ng/ml的β-HRG1、1～20μM的2-巯基乙醇以及1％的P/S培养基的步骤；用浓度为2.5～25μg/ml的PLO和2.5～25μg/ml的层粘连蛋白包被细胞培养容器后加入以上步骤所述的培养基，并以1×104～5×104个细胞/cm2的密度将神经干细胞接种至所述细胞培养容器的步骤；在保证细胞有足够的生长因子和养分的条件下定期更换所述的培养基至所述培养基中出现少突胶质前体细胞，也可每隔48h定期更换所述培养基。在少突胶质前体细胞分化过程中，细胞之间的相互作用影响分化效率，以1×104～5×104个细胞/cm2的接种密度在保证少突胶质前体细胞数量的基础上提高分化效率，当接种密度高于5×104个细胞/cm2或密度低于1×104个细胞/cm2时，制备同样数量的少突胶质前体细胞需要更长的分化时间。其中为了使分化的少突胶质前体细胞更接近或满足临床应用标准，包被细胞培养容器的层粘连蛋白(laminin)可优选为人源层粘连蛋白。进一步优选的是，所述的制备少突胶质前体细胞的方法中，神经干细胞以4×104个细胞/cm2的密度接种至所述细胞培养容器，在该条件下，自接种之日起5～10天可观察到少突胶质前体细胞，培养至纯度高于90％的少突胶质前体细胞，可进一步用于临床研究或作为细胞制剂的活性成分用来治疗髓鞘损伤相关的疾病。优选的是，所述制备少突胶质前体细胞的方法中，所述细胞培养容器为6孔板。在保证细胞密度的前提下，不排除其他细胞培养板或培养皿，如12孔板、24孔板或者根据实际需要分化的少突胶质细胞的量选择细胞培养皿进行分化。本专利技术实施例提供的制备少突胶质前体细胞的方法中用到的神经干细胞可根据本领域技术人员所熟知的各种方法制备得到的神经干细胞，优选的是，所述神经干细胞来源于骨髓间充质干细胞，由骨髓间充质干细胞根据本专利技术提供的方法制备的少突胶质前体细胞能够在无明显排斥反应情况下跨种属应用于髓鞘损伤治疗或其他研究。本专利技术实施例另一目的是提供一种能稳定控制由骨髓间充质干细胞制备少突胶质前体细胞过程并提高少突胶质前体细胞质量的方法。优选的是，所述制备少突胶质前体细胞的方法中，所述神经干细胞的制备方法包括以下步骤：配置包括含有终浓度为0.5％～2.5％的GlutaM本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于将神经干细胞分化为少突胶质前体细胞的培养基，其特征在于，所述培养基包括由Advanced DMEM/F12和Neurobasal medium混合而成的基础培养基，还包括终浓度为0.5～2.5％的GlutaMAX、1～5％的B27、0.5～2.5％的N2、2～25ng/ml的bFGF、2～25ng/ml的PDGF‑AA、25～250ng/ml的β‑HRG1、1～20μM的2‑巯基乙醇以及1％的P/S。

【技术特征摘要】
1.一种用于将神经干细胞分化为少突胶质前体细胞的培养基，其特征在于，所述培养基包括由AdvancedDMEM/F12和Neurobasalmedium混合而成的基础培养基，还包括终浓度为0.5～2.5％的GlutaMAX、1～5％的B27、0.5～2.5％的N2、2～25ng/ml的bFGF、2～25ng/ml的PDGF-AA、25～250ng/ml的β-HRG1、1～20μM的2-巯基乙醇以及1％的P/S。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基包括由AdvancedDMEM/F12和Neurobasalmedium以体积比为1:1混合而成的基础培养基，还包括终浓度为1％的GlutaMAX、2％的B27、1％N2、10ng/ml的bFGF、10ng/ml的PDGF-AA、100ng/ml的β-HRG1、10μM的2-巯基乙醇以及1％的P/S。3.根据权利要求1～2任一项所述的培养基制备少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：配置如权利要求1所述的培养基；用浓度为2.5～25μg/ml的PLO和2.5～25μg/ml的层粘连蛋白包被细胞培养容器后加入如权利要求1所述的培养基，并以1×104～5×104个细胞/cm2的密度将神经干细胞接种至所述细胞培养容器；定期更换如权利要求1所述的培养基至所述培养基中出现少突胶质前体细胞。4.根据权利要求3所述的制备少突胶质前体细胞的方法，其特征在于所述细胞培养容器为6孔板。5.根据权利要求3所述的制备少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，神经干细胞以4×104个细胞/cm2的密度接种至所述细胞培养容器。6.根据权利要求3所述的制备少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，所述神经干细胞的制备方法包括以下步骤：配置包括含有终浓度为0.5％～2.5％的GlutaMAX、1％...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐轶冰，王嘉显，陈应城，岑国欣，胡立基，林楷，
申请(专利权)人：南京艾尔普再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32