使用HLA-G阳性间充质干细胞治疗系统性红斑狼疮的方法技术方案

本发明专利技术涉及使用HLA‑G阳性间充质干细胞治疗系统性红斑狼疮的方法。具体地说，本发明专利技术一方面涉及制备用于治疗系统性红斑狼疮的人白细胞抗原‑G阳性的间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：(1)分离培养HLA‑G+脐带间充质干细胞、(2)HLA‑G+间充质干细胞冻存、(3)HLA‑G+间充质干细胞复苏。本发明专利技术方法所制得的间充质干细胞中有90％以上的细胞人白细胞抗原‑G呈阳性。已经发现，本发明专利技术HLA‑G+脐带间充质干细胞在治疗系统性红斑狼疮方面具有优异的治疗效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于干细胞治疗领域，涉及间充质干细胞治疗系统性红斑狼疮的方法，特别是涉及使用人白细胞抗原-G(通常缩写为HLA-G)阳性间充质干细胞(这种HLA-G阳性的间充质干细胞在本专利技术中可缩写为HLA-G+间充质干细胞)治疗系统性红斑狼疮的方法。通过本专利技术，可以为系统性红斑狼疮提供更为有效的治疗方案。
技术介绍
系统性红斑狼疮(简称SLE)是一种常见的免疫性疾病。病因尚不明确，其特点为整个免疫系统功能紊乱，细胞凋亡异常，淋巴细胞功能异常，其血清具有以抗核抗体为代表的多种自身抗体，造成全身多系统器官的慢性损害。传统激素免疫抑制剂的治疗方式副作用大，病人需终身服药。系统性红斑狼疮是一种累及多系统多器官的自身免疫病，患者体内免疫系统功能紊乱，T、B淋巴细胞异常活化，产生多种自身抗体和免疫复合物，导致患者皮肤、关节、肾脏等全身多个器官及系统受到损害。SLE好发于青年女性，男女比例为1：9，在我国成年女性中发病率为0.1％，高于西方国家的0.05％，且随着社会经济的发展及生活压力的增加，SLE的发病率日益上升，由于该病病程长且反复发作，给患者的心理和生理带来了极大的影响。SLE常用的治疗方法主要是通过服用糖皮质激素或免疫抑制剂等药物，以此来缓解因免疫系统攻击正常组织所造成的炎症反应和抑制免疫系统的作用。虽然糖皮质激素与免疫抑制剂被用于治疗系统性红斑狼疮使患者的预后有了明显改善，但是，SLE的治疗现状仍不容乐观：①目前仍然有约10％的患者在发病5年内死亡；②由于疾病的进展及一些治疗带来的副作用，如出现感染、骨髓抑制、骨质疏松、高血压、糖尿病等，尤其是细胞毒药物及糖皮质激素的应用，SLE患者的平均寿命明显短于正常人群；③常规的治疗方法只能减缓病情的发展速度，非根治疾病。因此，寻找一些高效、副作用少的新治方已迫在眉睫。自1996年开始用自体造血干细胞(HSC)移殖治疗SLE以来，在重症难治性SLE中取得了较好的疗效，但存在易复发的问题，而异基因HSC移殖治疗SLE虽能使部分患者病情长期缓解，但供体来源不足，病死率高达30％～50％，且治疗费用高。骨髓中除了HSC外还存在一种形态上类似成纤维细胞的间充质干细胞(MSC)，MSC具有多向分化潜能、免疫原性低与增殖速度快等特点。MSC不仅具有支持造血的功能，还具有免疫调节及诱导免疫耐受的功能，研究表明MSC发挥免疫调节及诱导免疫耐受的机理主要是：抑制T细胞增殖，使产生白细胞介素4(IL-4)的细胞数减少，产生干扰素γ(IFN-γ)的细胞数增加，调节Th1/Th2的平衡。MSC可通过多种途径调节炎症因子的释放、诱导免疫耐受、抑制自身免疫反应从而达到长期有效地治疗SLE。但是由于单纯的骨髓干细胞群体中MSC的含量极少，如果不通过体外的进一步扩增，很难达到治疗效果，且SLE是一种全身性疾病，单纯的使用MSC治疗，治疗效果有限，特别是对于一些重症SLE患者来说，短期内难以达到良好的治疗效果。近年来，干细胞移植技术已经应用于SLE的治疗。国内外开展骨髓来源的造血干细胞移植治疗SLE，取得了一定疗效，但存在移植源寻找困难、费用昂贵等问题，临床难以开展。并且，自体造血干细胞移植(HSCT，hematopoieticstemcelltransplant)存在高复发率的弊病，异体HSCT存在由于排异等原因造成死亡率较高。因此，提供一种能够更有效地使用间充质干细胞治疗系统性红斑狼疮的方法，对于本领域技术人员而言是非常迫切的。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种能够更有效地使用间充质干细胞治疗系统性红斑狼疮的方法。已经出人意料地发现，使用人白细胞抗原-G阳性间充质干细胞治疗系统性红斑狼疮是非常有临床价值的。本专利技术基于此发现而得以完成。为此，本专利技术第一方面提供了一种制备用于治疗系统性红斑狼疮的人白细胞抗原-G阳性的间充质干细胞(可缩写为HLA-G+间充质干细胞或者HLA-G+MSC)的方法，该方法包括以下步骤：步骤(1)、分离培养HLA-G+脐带间充质干细胞(11)采集脐带后，放入运输液中(这种运输液是本领域技术人员公知的，一种示例性的运输液的组成为：100ml低糖DMEM、1ml双抗、1μg/ml两性霉素)低温保存，带回实验室12h内进行处理；取培养基中5cm长的脐带组织置于超净工作台，D-HANKS溶液反复冲洗管腔及血管，洗去残留的血液直到冲洗液清澈；(12)纵行剖开脐带，将血管、尿管、管周及内外膜组织钝性撕掉；(13)用微量加样器取少量培养液到T25培养瓶中润湿培养瓶底部，弃去多余的培养液，将去血管后的组织剪碎到1mm×1mm×1mm大小的组织块，D-HANKS溶液反复冲洗，450×g、4℃离心10min，丢弃离心管下面的杂质细胞(例如有红细胞等)，重复3次；(14)取清洗离心后的组织块，以0.5cm的间距放置到湿润了的T25培养瓶中，每个瓶中放置约30个组织块，共放置10个培养瓶；置于37℃、5％CO2培养箱中孵育，以后每天用300μl的培养液湿润组织块，再弃去多余的液体，当有细胞从组织块中游出后，逐渐向培养瓶中增加培养液(但要避免组织块漂起)，当达到70％～80％融合度时，将贴壁细胞和组织块分别传代；(15)传代培养：(15a)贴壁细胞传代：清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取D-HANKS液加入每个培养瓶中，约为5ml/T25培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使D-HANKS液能充分清洗细胞表面，吸出D-HANKS液并弃去；消化：每瓶加入一定量的25％胰酶(通常的量为约2ml/T25瓶)，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；中止：每瓶加入2～5mL完全培养基，混匀，中止胰酶消化；收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用D-HANKS液冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；分选：细胞计数后用适当的培养液重悬细胞，浓度为1×107个/mL；分装为100μL，采用直接标记的一抗，分别加入CD11b、CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、HLA-G抗体于冰上孵育30min，采用流式细胞仪分选CD73+CD90+CD105+HLA-G+CD11b-CD34-CD45-细胞(即表达CD73、CD90、CD105、HLA-G，但不表达CD11b、CD34、CD45的细胞)；传代：将分选后细胞转入T25培养瓶中，每个培养瓶中补足3ml培养液，以后每周换2次液；细胞融合达到70-80％后，对细胞进行消化传代，在消化前一天全量换液；细胞消化计数(通常，10个培养瓶的细胞总数可达1.3×105个以上)，按1：3传代，2-3天细胞铺满底部，漩涡状密集分布，生长较一致；(15b)组织块传代：将有细胞游出的组织块小心本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备用于治疗系统性红斑狼疮的人白细胞抗原‑G阳性的间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：步骤(1)、分离培养HLA‑G+脐带间充质干细胞(11)采集脐带后，放入运输液中低温保存，带回实验室12h内进行处理；取培养基中5cm长的脐带组织置于超净工作台，D‑HANKS溶液反复冲洗管腔及血管，洗去残留的血液直到冲洗液清澈；(12)纵行剖开脐带，将血管、尿管、管周及内外膜组织钝性撕掉；(13)用微量加样器取少量培养液到T25培养瓶中润湿培养瓶底部，弃去多余的培养液，将去血管后的组织剪碎到1mm×1mm×1mm大小的组织块，D‑HANKS溶液反复冲洗，450×g、4℃离心10min，丢弃离心管下面的杂质细胞，重复3次；(14)取清洗离心后的组织块，以0.5cm的间距放置到湿润了的T25培养瓶中，每个瓶中放置约30个组织块，共放置10个培养瓶；置于37℃、5％CO2培养箱中孵育，以后每天用300μl的培养液湿润组织块，再弃去多余的液体，当有细胞从组织块中游出后，逐渐向培养瓶中增加培养液，当达到70％～80％融合度时，将贴壁细胞和组织块分别传代；(15)传代培养：(15a)贴壁细胞传代：清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取D‑HANKS液加入每个培养瓶中，约为5ml/T25培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使D‑HANKS液能充分清洗细胞表面，吸出D‑HANKS液并弃去；消化：每瓶加入一定量的25％胰酶，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2‑5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；中止：每瓶加入2～5mL完全培养基，混匀，中止胰酶消化；收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用D‑HANKS液冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；分选：细胞计数后用适当的培养液重悬细胞，浓度为1×107个/mL；分装为100μL，采用直接标记的一抗，分别加入CD11b、CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、HLA‑G抗体于冰上孵育30min，采用流式细胞仪分选CD73+CD90+CD105+HLA‑G+CD11b‑CD34‑CD45‑细胞；传代：将分选后细胞转入T25培养瓶中，每个培养瓶中补足3ml培养液，以后每周换2次液；细胞融合达到70‑80％后，对细胞进行消化传代，在消化前一天全量换液；细胞消化计数，按1：3传代，2‑3天细胞铺满底部，漩涡状密集分布，生长较一致；(15b)组织块传代：将有细胞游出的组织块小心挑出，移入新的培养皿，间隔5mm种植；加少量完全培养基湿润底部即可，待其贴壁后再补加一定量的完全培养基；待观察到有细胞从组织块游出后，隔天换液，游出组织块细胞2～3d迅速生长达到80％～90％的融合度，再次将细胞和组织块分别传代，方法同上面针对贴壁细胞传代的操作；共传代3次；细胞消化计数；步骤(2)、HLA‑G+间充质干细胞冻存(21)配制冻存液：按1份DMSO：2份人血清白蛋白：7份完全培养基比例配制，根据计数结果和冻存密度计算冻存液体积，冻存液需多配制10ml左右用于无菌检测，将配好的冻存液放入4度冰箱预冷；(22)离心：将待冻存细胞悬液离心，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；(23)混合与分装：细胞离心后移至生物安全柜，吸取并弃去上清液，加入一定体积的冻存液重悬细胞沉淀，混合均匀以后，按照固定的体积将细胞悬液分装至2ml冻存管中，放入冻存盒4度冰箱预冷30分钟；(24)程序降温：打开程序降温仪，设定好降温程序，输入细胞批号，连接液氮供给罐，启动程序，使程序降温仪腔体温度降至4度，将预冷好的冻存盒放入程序降温仪，开始降温，整个降温过程约为90分钟；(25)液氮储存：取出完成降温的冻存盒，放入冻存架中，放入MVE液氮储存罐中，填写完成储存位置表；步骤(3)、HLA‑G+间充质干细胞复苏(31)准备工作：打开水浴锅，配制完全培养基；(32)取细胞：根据所需细胞数量计算取出细胞管数，在细胞库存管理台账中记录取出时间和取出管数，并在储存位置表中相应位置进行标记；打开液氮储存罐，找到相应冻存架和冻存盒位置，取出细胞；(33)解冻：将细胞放入37度水浴锅中，迅速晃动，使细胞在1分钟内解冻；(34)去冻存液：由于冻存液中的DMSO在常温下对细胞有伤害作用，因此需迅速将解冻好的细胞悬液转移至装有完...

【技术特征摘要】
1.制备用于治疗系统性红斑狼疮的人白细胞抗原-G阳性的间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：步骤(1)、分离培养HLA-G+脐带间充质干细胞(11)采集脐带后，放入运输液中低温保存，带回实验室12h内进行处理；取培养基中5cm长的脐带组织置于超净工作台，D-HANKS溶液反复冲洗管腔及血管，洗去残留的血液直到冲洗液清澈；(12)纵行剖开脐带，将血管、尿管、管周及内外膜组织钝性撕掉；(13)用微量加样器取少量培养液到T25培养瓶中润湿培养瓶底部，弃去多余的培养液，将去血管后的组织剪碎到1mm×1mm×1mm大小的组织块，D-HANKS溶液反复冲洗，450×g、4℃离心10min，丢弃离心管下面的杂质细胞，重复3次；(14)取清洗离心后的组织块，以0.5cm的间距放置到湿润了的T25培养瓶中，每个瓶中放置约30个组织块，共放置10个培养瓶；置于37℃、5％CO2培养箱中孵育，以后每天用300μl的培养液湿润组织块，再弃去多余的液体，当有细胞从组织块中游出后，逐渐向培养瓶中增加培养液，当达到70％～80％融合度时，将贴壁细胞和组织块分别传代；(15)传代培养：(15a)贴壁细胞传代：清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取D-HANKS液加入每个培养瓶中，约为5ml/T25培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使D-HANKS液能充分清洗细胞表面，吸出D-HANKS液并弃去；消化：每瓶加入一定量的25％胰酶，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；中止：每瓶加入2～5mL完全培养基，混匀，中止胰酶消化；收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用D-HANKS液冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；分选：细胞计数后用适当的培养液重悬细胞，浓度为1×107个/mL；分装为100μL，采用直接标记的一抗，分别加入CD11b、CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、HLA-G抗体于冰上孵育30min，采用流式细胞仪分选CD73+CD90+CD105+HLA-G+CD11b-CD34-CD45-细胞；传代：将分选后细胞转入T25培养瓶中，每个培养瓶中补足3ml培养液，以后每周换2次液；细胞融合达到70-80％后，对细胞进行消化传代，在消化前一天全量换液；细胞消化计数，按1：3传代，2-3天细胞铺满底部，漩涡状密集分布，生长较一致；(15b)组织块传代：将有细胞游出的组织块小心挑出，移入新的培养皿，间隔5mm种植；加少量完全培养基湿润底部即可，待其贴壁后再补加一定量的完全培养基；待观察到有细胞从组织块游出后，隔天换液，游出组织块细胞2～3d迅速生长达到80％～90％的融合度，再次将细胞和组织块分别传代，方法同上面针对贴壁细胞传代的操作；共传代3次；细胞消化计数；步骤(2)、HLA-G+间充质干细胞冻存(21)配制冻存液：按1份DMSO：2份人血清白蛋白：7份完全培养基比例配制，根据计数结果和冻存密度计算冻存液体积，冻存液需多配制10ml左右用于无菌检测，将配好的冻存液放入4度冰箱预冷；(22)离心：将待冻存细胞悬液离心，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；(23)混合与分装：细胞离心后移至生物安全柜，吸取并弃去上清液，加入一定体积的冻存液重悬细胞沉淀，混合均匀以后，按照固定的体积将细胞悬液分装至2ml冻存管中，放入冻存盒4度冰箱预冷30分钟；(24)程序降温：打开程序降温仪，设定好降温程序，输入细胞批号，连接液氮供给罐，启动程序，使程序降温仪腔体温度降至4度，将预冷好的冻存盒放入程序降温仪，开始降温，整个降温过程约为90分钟；(25)液氮储存：取出完成降温的冻存盒，放入冻存架中，放入MVE液氮储存罐中，填写完成储存位置表；步骤(3)、HLA-G+间充质干细胞复苏(31)准备工作：打开水浴锅，配制完全培养基；(32)取细胞：根据所需细胞数量计算取出细胞管数，在细胞库存管理台账中记录取出时间和取出管数，并在储存位置表中相应位置进行标记；打开液氮储存罐，找到相应冻存架和冻存盒位置，取出细胞；(33)解冻：将细胞放入37度水浴锅中，迅速晃动，使细胞在1分钟内解冻；(34)去冻存液：由于冻存液中的DMSO在常温下对细胞有伤害作用，因此需迅速将解冻好的细胞悬液转移至装有完全培养基的离心管中；(35)离心：将装有细胞悬液的离心管放入离心机，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；(36)接种：将完全培养基移至培养瓶中，将离心后的细胞上清液吸出并弃去，使用完全培养基重悬细胞沉淀，加入培养瓶中，混匀后贴标签，放入二氧化碳培养箱中培养；传至P4～P6代，得到可用于临床治疗的HLA-G+间充质干细胞。2.根据权利要求1的方法，其所制得的间充质干细胞中有90％以上的细胞人白细胞抗原-G呈阳性。3.根据权利要求1的方法，其所制得的间充质干细胞中有95％以上的细胞人白细胞抗原-G呈阳性。4.根据权利要求1的方法，其所制得的间充质干细胞中有98％以上的细胞人白细胞抗原-G呈阳性。5.用于治疗系统性红斑狼疮的人白细胞抗原-G阳性间充质干细胞，其是通过包括以下步骤的方法制备得到的：步骤(1)、分离培养HLA-G+脐带间充质干细胞(11)采集脐带后，放入运输液中低温保存，带回实验室12h内进行处理；取培养基中5cm长的脐带组织置于超净工作台，D-HANKS溶液反复冲洗管腔及血管，洗去残留的血液直到冲洗液清澈；(12)纵行剖开脐带，将血管、尿管、管周及内外膜组织钝性撕掉；(13)用微量加样器取少量培养液到T25培养瓶中润湿培养瓶底部，弃去多余的培养液，将去血管后的组织剪碎到1mm×1mm×1mm大小的组织块，D-HANKS溶液反复冲洗，450×g、4℃离心10min，丢弃离心管下面的杂质细胞，重复3次；(14)取清洗离心后的组织块，以0.5cm的间距放置到湿润了的T25培养瓶中，每个瓶中放置约30个组织块，共放置10个培养瓶；置于37℃、5％CO2培养箱中孵育，以后每天用300μl的培养液湿润组织块，再弃去多余的液体，当有细胞从组织块中游出后，逐渐向培养瓶中增加培养液，当达到70％～80％融合度时，将贴壁细胞和组织块分别传代；(15)传代培养：(15a)贴壁细胞传代：清洗：将培养瓶中的培养基吸出并弃去，吸取D-HANKS液加入每个培养瓶中，约为5ml/T25培养瓶，将培养瓶横放并轻轻晃动，使D-HANKS液能充分清洗细胞表面，吸出D-HANKS液并弃去；消化：每瓶加入一定量的25％胰酶，盖上瓶盖，将培养瓶横放，使胰酶覆盖细胞表面，室温消化约2-5分钟，在倒置显微镜下观察细胞状态，当所有细胞均变圆并脱离培养瓶时，轻拍培养瓶壁，使所有细胞脱落并悬浮于培养瓶中，显微镜下观察确保所有细胞均脱落后，将培养瓶移至生物安全柜中；中止：每瓶加入2～5mL完全培养基，混匀，中止胰酶消化；收集：用移液管吸取培养瓶中的细胞悬液，并收集至50ml离心管中，再用D-HANKS液冲洗培养瓶，确保所有细胞均被收集；离心：将离心管放入台式离心机中，配平，调整转速1500rpm，时间5分钟，升速9，降速7，开始离心；重悬：离心结束后，取出离心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并弃去，用完全培养基重悬细胞沉淀，将多管细胞悬液合并为一管，混匀后取样计数及检测细胞存活率；分选：细胞计数后用适当的培养液重悬细胞，浓度为1×107个/mL；分装为100μL，采用直接标记的一抗，分别加入CD11b、CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、HLA-G抗体于冰上孵育30min，采用流式细胞仪分选CD73+CD90+CD105+HLA-G+CD11b-CD34-CD45-细胞；传代：将分选后细胞转入T25培养瓶中，每个培养瓶中补足...

【专利技术属性】
技术研发人员：许晓椿，肖海蓉，刘冰，
申请(专利权)人：博雅干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32