区别间充质干细胞的方法及测定间充质干细胞的纯度的方法技术

本发明专利技术提供了一种区别间充质干细胞的方法及测定间充质干细胞的纯度的方法。具体地，本发明专利技术提供一种区别间充质干细胞(MSC)与纤维母细胞的方法。本发明专利技术还提供增加细胞培养物中的间充质干细胞(MSC)群体的纯度的方法。上述方法各自包含通过标记物CD146从源自胎盘相关组织的细胞培养物中分选或分离细胞的步骤。本发明专利技术还提供评估源自胎盘相关组织的细胞培养物中的间充质干细胞(MSC)的纯度的方法，包含测定该培养物中表达CD146的细胞的百分比。

Methods to distinguish mesenchymal stem cells and methods for determining the purity of mesenchymal stem cells

The present invention provides a method for distinguishing mesenchymal stem cells and determining the purity of mesenchymal stem cells. In particular, the present invention provides a method for distinguishing mesenchymal stem cells (MSC) and fibroblasts. The invention also provides a method for increasing the purity of mesenchymal stem cells (MSC) populations in cell cultures. Each of these methods contains the steps of separating or separating cells from the cell cultures derived from the placental related tissue by the marker CD146. The invention also provides a method for evaluating the purity of mesenchymal stem cells (MSC) derived from placenta related tissues, including the percentage of cells expressing CD146 in the culture.

【技术实现步骤摘要】
区别间充质干细胞的方法及测定间充质干细胞的纯度的方法
本专利技术涉及在源自胎盘相关组织的细胞培养物中区别间充质干细胞(MSC)的方法。本专利技术还涉及在源自胎盘相关组织的细胞培养物中增加间充质干细胞(MSC)群体的纯度的方法。另一方面，本专利技术涉及评估源自胎盘相关组织的细胞培养物中的间充质干细胞(MSC)的纯度的方法。
技术介绍
间充质干细胞或基质细胞(Mesenchymalstemorstromalcells，MSC)是属于胚胎中胚层来源的多能性细胞，具有类纤维母细胞的形态。所述细胞视刺激及培养条件可分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、神经系细胞及肌细胞与其它细胞类型。虽然人类间充质干细胞(hMSC)的可塑性及其在组织修复与再生的作用已被广泛研究，近来得到最多的关注的是其免疫调控性质[1-2]。人类间充质干细胞已从各种组织分离出。最常用的MSC来源为骨髓(bonemarrow,BM)。然而，其分离程序为极具侵入性的。为避免侵入性的分离程序，诸如人类脐带及胎盘的组织由于通常在生产后被丢弃而被视为良好的候选物。先前研究已证实hMSC可自脐带或胎盘有效率的分离[3]。MSC为包含在间充质组织中的更复杂的基质细胞组成的子群体。由于间充质干细胞的异质性及对其具有特异性的已知生物标记物的缺乏，定义MSC表型及特征是一项具挑战性的任务[4-6]。负责MSC功能的分子组份(特别是在细胞膜上的)大多数仍属未知。此外，特异性细胞表面标记物的缺乏使得细胞培养处于可能为其它细胞类型污染的风险中，特别是诸如纤维母细胞的成熟基质细胞，其相对地大量存在于间充质组织中[4-6]。在从胎盘源组织分离MSC的过程中，非MSC(包括纤维母细胞、胎盘源上皮细胞及胎盘源网状细胞)常常在体外培养中与MSC共存。纤维母细胞尤其是污染的主要来源。纤维母细胞被视为成熟间充质细胞，尤其大量存在于结缔组织中。因此，该细胞为许多细胞培养系统中最常存在的污染细胞表型。不仅成功地从培养物去除纤维母细胞的技术困难，在相同培养物中区别MSC与纤维母细胞也尤为复杂。纤维母细胞及MSC具有极相似的形态外观；二者均可良好地增生并具有许多相同的细胞表面标记物[7-8]。国际细胞治疗研讨会(InternationalSocietyofCellularTherapy,ISCT)目前定义MSC为表达CD73、CD90及CD105的具有塑料贴附性的多能性类纤维母细胞的细胞，且不表达造血标记物CD14、CD34及CD45。然而，纤维母细胞亦具有所述性质及标记物。因此，目前由ISCT建议的定义无法区别MSC与一般纤维母细胞。至今，区别MSC与纤维母细胞的最佳方式是基于这两种细胞的功能特性的分析；MSC保留多能性干细胞性及免疫调控能力，而纤维母细胞在此二功能特性中皆显得较为受限。自Friedenstein在辨别MSC上的开创性成果以来[48]，在寻求稳定且明确地区别离体培养扩增的MSC与纤维母细胞方面，培养衍生方法学、形态学及基因表达特征并无明显的差异[9-12]。目前，对于分离MSC与纤维母细胞不存在公认的标准或单一细胞表面标记物。由于纤维母细胞为常见于源自胎盘的MSC培养物中的污染细胞群体的事实，作为生物标记物以区别MSC与纤维母细胞的新颖表面蛋白对于确保胎盘源MSC的初代培养的均一性极为重要。CD146(黑素瘤细胞粘附分子，melanomacelladhesionmolecule，MCAM)是一种血管内皮细胞的表面标记物，通过促进细胞-细胞相互作用以及血管生成作用而发挥功能。最近的研究揭露，一些间充质干细胞(MSC)会表达CD146[13-14、16]，而且CD146的表达量与其自我更新能力或分化成脂肪细胞以及成骨能力有关[13、15]。此外，自不同组织分离的间充质干细胞(MSC)表现出不同的CD146表达量：从骨髓分离的间充质干细胞(MSC)约有40％表达CD146，且其表达量随着继代次数增加而降低[13-15]，而从脂肪组织分离的间充质干细胞(MSC)只有少于10％表达CD146[14]。美国第9,470,685号专利公开一种使用在间充质干细胞(MSC)上表达的标记物EphA2以区别间充质干细胞(MSC)和纤维母细胞的方法。
技术实现思路
在本专利技术中意外地发现，基于特异性的表面标记物CD146(黑素瘤细胞粘附分子，melanomacelladhesionmolecule，MCAM)的表达量，可以在源自胎盘相关组织的细胞培养物中区别间充质干细胞(MSC)。因此，在一方面，本专利技术提供一种区别间充质干细胞(mesenchymalstemcells(MSC)与纤维母细胞的方法，包含使用在MSC上表达的标记物CD146从纤维母细胞中分离出MSC，以区别MSC与纤维母细胞，其中所述MSC与纤维母细胞来自源自胎盘相关组织的细胞培养物。在本专利技术的部分具体实施例中，该方法进一步包含以下的初步步骤：从该胎盘相关组织收集MSC与纤维母细胞；以及在一培养基中培养MSC与纤维母细胞以制备该细胞培养物。另一方面，本专利技术提供一种增加细胞培养物中的间充质干细胞(MSC)群体的纯度的方法，包含使用在MSC上表达的标记物CD146分离并收集MSC，其中所述MSC来自源自胎盘相关组织的细胞培养物；以及培养所述MSC。根据本专利技术，该胎盘相关组织可选自羊膜、绒毛膜盘、绒毛膜及脐带。在一较佳具体实施例中，该胎盘相关组织为脐带。根据本专利技术，分选步骤可使用本领域已知或待开发的技术进行，例如一基于抗体或一基于核苷酸的分离方法。在本专利技术的部分具体实施例中，该源自胎盘相关组织的细胞培养于一间充质干细胞用的培养基中。另一方面，本专利技术提供一种评估在源自胎盘相关组织的细胞培养物中的间充质干细胞(MSC)的纯度的方法。该方法包含测定在该培养物中表达CD146的细胞的百分比的步骤。根据本专利技术，所述MSC的纯度与该表达CD146的细胞的百分比具有正相关性。在本专利技术的较佳具体实施例中，该表达CD146的细胞的百分比通过流式细胞法测定。在一具体实施例中，所述MSC的纯度通过以下的方程计算：Y＝SX+I，其中Y为间充质干细胞(MSC)的纯度(％)，X为表达CD146的细胞的百分比，S为自1.129至1.283之间的数值，且I为自-28.676至-17.964之间的数值。应了解先前的一般描述及以下的详述两者皆仅为示例性及解释性且并不限制本专利技术。附图说明本专利技术先前的概述以及以下详述在配合随附附图阅读时得以更佳地被了解。为说明本专利技术，在附图中显示目前较佳的实施例在附图中：图1显示间充质干细胞(MSC)和纤维母细胞的混合群体的流式细胞仪分析的结果。将来自捐献者的脐带的MSC与不同比例的纤维母细胞混合。结果显示由流式细胞仪侦测到的CD146+群体的百分比相应于增加的纤维母细胞群体而成比例减少。FB＝纤维母细胞。图2显示以流式细胞仪分析不同继代数的源自脐带的MSC的CD146表达量的分析结果。图3显示在源自胎盘相关组织的细胞培养物中MSC的纯度(％)与表达CD146的细胞的百分比之间的线性回归。图4A显示CD146高的MSC和CD146低的MSC的CD146的表达量。图4B显示来自CD146高的MSC与CD146低的MSC的脂肪生成分化的结果。其中，每组平均本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种区别间充质干细胞与纤维母细胞的方法，包含：使用在间充质干细胞上表达的标记物CD146从纤维母细胞中分离出间充质干细胞，以区别间充质干细胞与纤维母细胞，其中所述间充质干细胞与纤维母细胞来自源自胎盘相关组织的细胞培养物。

【技术特征摘要】
2016.08.31 US 62/381,9341.一种区别间充质干细胞与纤维母细胞的方法，包含：使用在间充质干细胞上表达的标记物CD146从纤维母细胞中分离出间充质干细胞，以区别间充质干细胞与纤维母细胞，其中所述间充质干细胞与纤维母细胞来自源自胎盘相关组织的细胞培养物。2.根据权利要求1所述的方法，其中该胎盘相关组织选自羊膜、绒毛膜盘、绒毛膜及脐带。3.根据权利要求2所述的方法，其中该胎盘相关组织为脐带。4.根据权利要求1所述的方法，其中该分离的步骤通过一基于抗体或一基于核苷酸的分离方法进行。5.根据权利要求1所述的方法，进一步包含以下的初步步骤：从该胎盘相关组织收集间充质干细胞与纤维母细胞；以及在一培养基中培养间充质干细胞与纤维母细胞以制备该细胞培养物。6.根据权利要求4所述的方法，其中该基于抗体的分离方法为一基于抗体的磁性细胞分选或一基于抗体的流式细胞法。7.根据权利要求4所述的方法，其中该基于核苷酸的分离方法为一基于核苷酸的流式细胞法。8.一种增加细胞培养物中的间充质干细胞群体的纯度的方法，包含：使用在间充质干细胞上表达的标记物CD146分离并收集间充质干细胞，其中所述间充质干细胞来自源自胎盘相关组织的...

【专利技术属性】
技术研发人员：宣昶有，林卫理，苏郁清，刘威廷，李孟玮，杜茂宽，
申请(专利权)人：宣捷生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾,71