重组犬PD-1融合蛋白及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供重组犬PD‑1融合蛋白及其制备方法与应用，所述融合蛋白由犬PD‑1蛋白胞外区或犬PD‑1蛋白胞外区突变体直接或间接与Fc片段相连而成。本发明专利技术提供的重组犬PD‑1融合蛋白与野生型PD‑1相比，具有更高的亲和力以及更好的药效，为犬肿瘤的免疫治疗提供了更多选择。

Recombinant canine PD-1 fusion protein and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
重组犬PD-1融合蛋白及其制备方法与应用
本专利技术涉及生物医药领域，具体地说，涉及两种新型的重组犬PD-1融合蛋白及其制备方法与应用。
技术介绍
PD-1，称作程序性细胞死亡受体1(又称为PDCD1)，是大小为50～55KD的I型膜糖蛋白，属于CD28超家族受体，是一种重要的免疫抑制分子。PD-1蛋白主要在T细胞(包括抗原刺激活化的T细胞)、B淋巴细胞和活化的巨噬细胞表面表达，骨髓细胞也表达PD-1。PD-1具有两个配体—PD-L1和PD-L2。在正常生理情形下，PD-1与PD-L1/PD-L2结合抑制T细胞的活化及细胞因子的产生，进而保护机体免受自身免疫系统攻击。但是，多种实体瘤以及一些血液恶性肿瘤，包括黑色素瘤、霍奇金淋巴瘤细胞系、肺癌、食管癌、胃癌、大肠癌、乳腺癌、肝癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、胰腺癌等细胞表面也大量表达PD-L1。肿瘤细胞膜上的PD-L1与T细胞上的PD-1结合，下调T细胞活化和细胞因子分泌，成功逃避机体免疫系统的识别和攻击，导致肿瘤细胞的免疫逃逸。同时研究发现肿瘤细胞上PD-L1的表达与多个肿瘤类型的不良预后相关。阻断PD-1和PD-L1相互作用成为治疗肿瘤的一条有效途径。目前针对PD-1/PD-L1相互作用的抗肿瘤药物大多为抗PD-1或PD-L1的单抗药物，包括PD-1单抗药物，如百时美施贵宝(BMS)公司的纳武单抗(Nivolumab)、默克(Merck)公司的派姆单抗(Pembrolizumab)，PD-L1单抗药物，如罗氏旗下基因泰克的阿特朱单抗(Atezolizumab)、阿斯利康的得瓦鲁单抗(Durvalumab)、辉瑞与默沙东的Avelumab。这些单抗类药物主要用于治疗人恶性肿瘤，包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤、头颈鳞状细胞癌等，单抗治疗取得了一定的治疗效果，但是也存在一定局限性，如平均治疗有效率较低(单药有效率20％左右)、高免疫原性、个体差异性以及适应症有限等，因此亟需新的、高效性候选肿瘤药物的开发。PD-1融合蛋白是针对PD-1/PD-L1信号通路的一种新的肿瘤药物，可竞争性的结合肿瘤细胞的PDL-1/PD-L2配体，阻断肿瘤细胞和T细胞结合，从而恢复T细胞的活化以及提高细胞因子分泌水平，增强免疫应答。PD-1融合蛋白相关药物在人上的应用及研究鲜有报道，在犬肿瘤上的研究仍处于空白阶段。犬肿瘤性疾病是比较常见的疾病，包括黑色素瘤、乳腺癌、肥大细胞瘤、脂肪瘤等，约四分之一的犬在一生中的某个阶段会发生肿瘤疾病，老年犬更加常见，十岁以上犬中几乎50％以上比例会出现肿瘤疾病。犬肿瘤的治疗方法主要是手术、化疗、放疗，国外应用的主要治疗药物有洛莫司汀、长春花碱等化疗药物以及泼尼松龙等糖皮质激素药物，但是这些药物毒副作用大，对自身损伤严重；目前国内尚未有犬用肿瘤药物上市，处于市场空白。本专利技术提供了犬PD-1融合蛋白，其专门针对犬肿瘤疾病，通过增强T细胞的抗肿瘤功能，辅助自身免疫系统清除肿瘤细胞，有效性高，且对机体损伤较小。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供两种新型的重组犬PD-1融合蛋白及其制备方法与应用。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供两种新型的重组犬PD-1融合蛋白，一种融合蛋白由犬PD-1蛋白胞外区直接或间接与Fc片段相连而成，另一种融合蛋白犬PD-1蛋白胞外区突变体直接或间接与Fc片段相连而成。所述犬PD-1蛋白胞外区为：(a)由SEQIDNO:5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(b)SEQIDNO:5所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。所述犬PD-1蛋白胞外区突变体为：(c)由SEQIDNO:6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(d)SEQIDNO:6所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(c)衍生的蛋白质。所述Fc片段包含免疫球蛋白铰链区、CH2和CH3区。所述免疫球蛋白来自人或哺乳动物，优选人或犬、猫、猪、鼠、马、牛等哺乳动物，更优选犬IgG1免疫球蛋白。所述融合蛋白由犬PD-1蛋白胞外区或犬PD-1蛋白胞外区突变体直接或间接与Fc片段之间通过Linker连接而成。其中，所述Linker是由2-20个柔性氨基酸组成的柔性多肽，所述柔性氨基酸选自Gly、Ser、Ala、Thr中的至少一种。优选地，所述Linker为(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n为2-5之间的整数，更优选n为2。进一步地，两种新型的重组犬PD-1融合蛋白分别为cPD1-Fc、cPD1mu-Fc；融合蛋白cPD1-Fc为：(e)由SEQIDNO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(f)与SEQIDNO:1所示的氨基酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的由(e)衍生的蛋白质。融合蛋白cPD1mu-Fc为：(g)由SEQIDNO:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(h)与SEQIDNO:3所示的氨基酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的由(g)衍生的蛋白质。第二方面，本专利技术提供含有所述重组犬PD-1融合蛋白编码基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系等。第三方面，本专利技术提供所述重组犬PD-1融合蛋白的制备方法，所述方法包括：人工合成所述融合蛋白的编码基因，并进行密码子优化，将优化后的基因构建到真核表达载体中，转入真核细胞，并在真核细胞中表达，分离纯化目标蛋白。优选地，所述真核表达载体为pcDNA3.1，所述真核细胞为CHO细胞。优化后的cPD1-Fc和cPD1mu-Fc的核苷酸序列分别如SEQIDNO:2和4所示。第四方面，本专利技术提供所述重组犬PD-1融合蛋白的以下任一应用：1)用于犬肿瘤及相关疾病的治疗，包括促进肿瘤缩小或有效控制肿瘤生长，提高患犬生活质量；2)用于制备犬抗肿瘤药物或组合物。第五方面，本专利技术提供一种犬抗肿瘤药物或组合物，有效成分为所述重组犬PD-1融合蛋白。所述肿瘤包括但不限于黑色素瘤(如恶性黑色素瘤)、淋巴瘤、肥大细胞瘤、肉瘤、头颈部肿瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、尿路上皮癌、膀胱癌。进一步地，本专利技术还提供了所述的犬PD-1融合蛋白或其制剂单独应用或联合手术、放射疗法、化学疗法、免疫疗法、激素疗法、基因疗法、血管生成抑制疗法、姑息治疗等一种或几种治疗方法用于治疗犬肿瘤相关疾病。第六方面，本专利技术提供一种犬PD-1蛋白突变体或犬PD-1蛋白截短体的突变体，所述突变体含有位于犬PD-1蛋白氨基酸序列第132位残基的T→L的突变位点。应理解的是，经过改造的蛋白，包括犬cPD1-Fc和cPD1mu-Fc融合蛋白或犬PD-1胞外区及其突变体蛋白与犬Fc或与其他蛋白融合构成的不改变蛋白活性的融合蛋白，均属于本专利技术的保护范围。经过修饰的蛋白，包括两种融合蛋白cPD1-Fc、cPD1mu-F本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组犬PD-1融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由犬PD-1蛋白胞外区或犬PD-1蛋白胞外区突变体直接或间接与Fc片段相连而成；/n所述犬PD-1蛋白胞外区为：/n(a)由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或/n(b)SEQ ID NO:5所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质；/n所述犬PD-1蛋白胞外区突变体为：/n(c)由SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或/n(d)SEQ ID NO:6所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(c)衍生的蛋白质。/n

【技术特征摘要】
1.重组犬PD-1融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由犬PD-1蛋白胞外区或犬PD-1蛋白胞外区突变体直接或间接与Fc片段相连而成；
所述犬PD-1蛋白胞外区为：
(a)由SEQIDNO:5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
(b)SEQIDNO:5所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质；
所述犬PD-1蛋白胞外区突变体为：
(c)由SEQIDNO:6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
(d)SEQIDNO:6所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(c)衍生的蛋白质。


2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述Fc片段包含免疫球蛋白铰链区、CH2和CH3区；
所述免疫球蛋白来自人或哺乳动物，优选犬、猫、人、猪、鼠、马、牛IgG1免疫球蛋白。


3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由犬PD-1蛋白胞外区或犬PD-1蛋白胞外区突变体直接或间接与Fc片段之间通过Linker连接而成；所述Linker是由2-20个柔性氨基酸组成的柔性多肽，所述柔性氨基酸选自Gly、Ser、Ala、Thr中的至少一种；
优选地，所述Linker为(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n为2-5之间的整数，更优选n为2。


4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为cPD1-Fc或cPD1mu-Fc；
融合蛋白cPD1-Fc为：
(e)由SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗昊澍，朱丽娜，师磊，于金库，韩国，熊剑胜，
申请(专利权)人：北京伟杰信生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11