一种兽用重组绒促性素的纯化方法技术

本发明专利技术涉及蛋白质纯化技术领域，具体公开一种兽用重组绒促性素的纯化方法。本发明专利技术提供的纯化方法包括，MMC复合层析、离子交换层析和疏水层析。经过上述的纯化方法，得到的重组hCG纯度高(98％以上)、比活高(20900IU/mg)，并且纯化得率高(65％以上)。整个生产过程不涉及污染环境有机溶剂、更环保、成本更低，可适用于兽用rhCG大规模纯化。用rhCG大规模纯化。

【技术实现步骤摘要】
一种兽用重组绒促性素的纯化方法


[0001]本专利技术涉及蛋白质纯化领域，特别是兽用重组人绒毛膜促性腺激素(rhCG)的纯化。

技术介绍

[0002]人绒毛膜促性激素(hCG)是一种由人胎盘合体滋养层细胞分泌的糖蛋白激素，可以促进雌性动物卵巢卵泡成熟，诱导排卵，以及促进雌激素的合成和分泌。在人临床上，hCG常用于辅助生殖治疗，治疗不孕不育等。在动保行业，hCG常用于母畜，包括猪、牛、羊等的同期发情和超数排卵。在水产行业，hCG常用于鱼类的人工催熟催产、排卵产精，是鱼类人工繁殖的首选催产剂之一。
[0003]商品化hCG最初是从孕妇尿中提取纯化的提取物，但大规模收集孕妇尿难度大、成本高，纯化得到的hCG产品批次差异大，且存在尿液供体带来的安全风险。Merck Serono研发了重组hCG，以用于人辅助生殖，连续使用五步色谱层析，最终获得效价为25000IU/mg的高纯度、高活性重组hCG产品(CN 100482679C)，但是纯化过程复杂、得率低，纯化成本高。目前国内已公开数据显示，经纯化后的rhCG单位效价大多都≤10000IU/mg，如专利技术专利CN102485752B、CN111303274A、CN105968185A等。但在纯化过程中均不同程度的使用了污染环境或有害试剂如异丙醇、二硫苏糖醇(DTT)和β
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巯基乙醇等，存在环境污染的风险。
[0004]本专利技术提供了一种兽用重组人绒毛膜促性腺激素(rhCG)的纯化方法，仅需3步常规层析步骤，无层析柱装柱技术特别要求，操作简便，不会因此增加工艺放大困难系数。纯化纯度在98％以上，得率高，得率至少65％，纯化原液比活达20000IU/mg。比活高，成本低，满足低附加值的畜牧和水产生产。另外，整个生产过程不涉及有机溶剂，环境友好、更环保。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是解决重组hCG，尤其是哺乳动物细胞表达的rhCG的纯化问题，得到纯度高、活性高的兽用重组hCG精纯品。
[0006]本专利技术的另一目的是提供一种可适用于大规模生产的重组hCG纯化工艺。
[0007]为了达到上述目的，本专利技术提供了以下的重组hCG纯化步骤：
[0008](0)深层过滤；
[0009](1)MMC复合层析；
[0010](2)离子交换层析；
[0011](3)疏水层析。
[0012]其中，各纯化步骤按先后顺序进行。
[0013]在本专利技术所述的重组hCG纯化方法中，纯化起始材料为使用哺乳动物细胞
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中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达系统表达的细胞培养上清液，也适用其他表达系统，包括但不限于大肠杆菌、酵母细胞，表达获得的培养上清液。
[0014]在本专利技术所述的重组hCG纯化方法中，在复合层析步骤之前，为了去除较大颗粒，
以免堵塞柱子，最好进行一次深层过滤步骤。
[0015]在本专利技术所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(1)采用一种偶联复合型阳离子配基MMC复合层析介质。
[0016]在本专利技术所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(1)中，洗脱优选弱酸性缓冲液。适合的缓冲液包括NaAC/HAC缓冲液、Tris
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HCl缓冲液，磷酸盐缓冲液。最优选pH5.5的NaAC/HAC缓冲液。
[0017]在本专利技术所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(1)中，NaAC/HAC洗脱缓冲液的浓度在10～100mM；优选50mM。
[0018]本专利技术提供的纯化方法中，采用混合模式层析作为第一步层析，混合模式层析(Mixed
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Mode Chromatography，MMC)是一种基于蛋白质与层析配基分子间多种相互作用的层析技术。混合模式层析旨在从经过澄清的细胞上清液中直接捕获中度纯化的目的蛋白hCG，与传统色谱相比，具有高分离度，高选择性，高样品负载量，高速度等优点。
[0019]在本专利技术中MMC层析发挥了高重组hCG载量，低单位成本的作用，本专利技术提供的MMC层析通过对缓冲体系、平衡液盐含量、平衡液pH等条件不断优化，进行改进，使得层析柱对重组hCG具备更高的载量，并且本专利技术中MMC层析采用pH为5.5的NaAC/HAC缓冲液，完成重组hCG的洗脱；更进一步的，本专利技术提供的洗脱液中含有Arg(精氨酸)，Arg能够促进目的蛋白与层析配基分子间的解离且防止目的蛋白自身聚集，使得洗脱得到更高性能的重组hCG，能够更好的保持重组hCG的稳定性。对于维持目的蛋白重组hCG的活性具有重要意义。
[0020]在本专利技术所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(2)层析介质采用单分散聚苯乙烯
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二乙烯基苯共聚物基球。
[0021]在本专利技术所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(2)中，洗脱液为Tris
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HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液；优选Tris
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HCl缓冲液。
[0022]在本专利技术所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(2)中，Tris
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HCl缓冲液的pH为5.5。
[0023]在本专利技术所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(2)中，Tris
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HCl缓冲液浓度在5～20mM；优选8～15mM；最佳优选10mM。
[0024]本专利技术选择聚苯乙烯
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二乙烯基苯共聚物基球的离子交换层析，作为第二步层析。并且本专利技术通过调节平衡液盐离子强度，确保离子交换层析获得更高的重组hCG载量的同时，能够维持重组hCG的稳定。
[0025]在本专利技术所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(3)采用一种偶联苯基疏水基团的疏水交换层析介质。旨在对上述步骤所得重组hCG蛋白进一步的提纯。
[0026]在本专利技术所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(3)中，选用Tris
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HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液，特别优选Tris
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HCl缓冲液。
[0027]在本专利技术所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(3)中，Tris
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HCl缓冲液pH值在6.0～10；优选pH6.0～9.0；特别优选pH值7.5。
[0028]在本专利技术所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(3)所述的疏水交换层析采用目的蛋白流穿模式。
[0029]作为本专利技术的一个具体实施例方式，在本专利技术所述的重组hCG纯化方法中，重组hCG经受以下步骤：
[0030](0)深层过滤；
[0031](1)在MMC复合层析介质上用10～100mM的NaAC/HAC，0.3～0.4M的NaCl，0.3～0.4M Arg，pH值为5.5的缓冲液作为洗脱液，进行洗脱；
[0032](2)将步骤(1)的洗出液在以单分散聚苯乙烯
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二乙烯基苯共聚物基球为支撑的填料介质上进行阳离子交换层析，以5～20mM Tris
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HC缓冲液，0.4～0.6本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组hCG的纯化方法，其特征在于，所述的纯化方法中，使rhCG经受以下步骤：(1)复合层析；(2)阳离子交换层析；(3)疏水层析。2.根据权利要求1所述的重组hCG的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，复合层析介质偶联一种复合型阳离子配基MMC。3.根据权利要求2所述的重组hCG的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所用洗脱液含有0.3～0.4M精氨酸。4.根据权利要求3所述的重组hCG的纯化方法，其特征在于，步骤(1)所述的复合层析用10～100mM的NaAC/HAC缓冲液作为洗脱液，其pH值为5.5。5.根据权利要求4所述的重组hCG的纯化方法，其特征在于，步骤(2)所述的阳离子交换层析采用单分散聚苯乙烯
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二乙烯基苯共聚物基球。6.根据权利要求5所述的重组hCG的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，洗脱液为5～20mM Tris
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HCl，pH5.5。7.根据权利要求6所述的重组hCG的纯化方法，其特征在于，步骤(3)所述的疏水交换层析介质基质偶联苯基作为疏水...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗昊澍，于金库，裴慧玲，师磊，韩国，熊剑胜，
申请(专利权)人：北京伟杰信生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：