重组犬PD-1和犬SIRPα双融合蛋白的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及犬类肿瘤治疗领域，公开了重组犬PD

【技术实现步骤摘要】
重组犬PD
‑
1和犬SIRP
α
双融合蛋白的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及犬类肿瘤治疗领域，具体涉及一种融合蛋白、编码如上所述的融合蛋白的核酸，一种含有所述融合蛋白的编码基因的生物材料，一种用于生产如上所述的融合蛋白的制备方法，一种药物组合物，一种试剂盒，所述融合蛋白、核酸或生物材料在制备治疗犬类由过表达CD47和/或PD
‑
L1引起的疾病的药物中的应用。

技术介绍

[0002]肿瘤是人类和动物的一种常见病、多发病，其中犬恶性肿瘤已经成为导致犬死亡的主要原因。国外研究报告数据显示：每4只犬中就有一只被诊断为肿瘤；10岁以上犬患肿瘤的比例更是高达50％以上。目前犬肿瘤的临床治疗手段主要包括手术、化学治疗和放射性治疗。常见的化疗药物包括环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙等，这些均存在肿瘤特异性差和毒副作用大等缺点。目前国外已有一些小分子药物和蛋白药物被批准用于治疗犬肿瘤，但是在国内这方面尚处于市场空白。
[0003]程序性细胞死亡受体1(PD
‑
1)，是一个大小约55kDa的Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于CD28超家族受体，主要在T细胞、B淋巴细胞和活化的巨噬细胞表面表达。PD
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1蛋白有两个配体：PD
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L1和PD
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L2。在正常生理条件下，PD
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1与PD
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L1/PD
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L2的结合会抑制T细胞的活化，进而保护机体免受自身免疫系统的攻击；但是，多种实体瘤以及一些血液瘤，包括黑色素瘤、乳腺癌、各种消化系统肿瘤、淋巴瘤、白血病等癌细胞也大量表达PD
‑
L1。肿瘤细胞膜上的PD
‑
L1与T细胞上的PD
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1结合，抑制T细胞的活化，从而成功逃避机体免疫系统的识别和攻击，实现肿瘤细胞的免疫逃逸。同时研究发现，肿瘤细胞上PD
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L1的表达与多个肿瘤类型的不良预后相关。因此阻断PD
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1和PD
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L1相互作用成为治疗肿瘤的一条有效途径。
[0004]CD47
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SIRPα(signal
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regulatory proteinα)信号通路又被称为“别吃我”信号。SIRPα属于SIRP受体家族蛋白，主要表达于髓系细胞表面(单核细胞、巨噬细胞、粒细胞以及髓系DC细胞等)，也在神经系统的神经元细胞中表达。CD47是SIRPα最主要的配体，是一种在正常细胞表面广泛表达的跨膜蛋白，分子量大约为50kDa，属于免疫球蛋白超家族。在正常生理条件下，细胞膜上的CD47与巨噬细胞表面的SIRPα结合，进而抑制巨噬细胞的吞噬作用。这种功能可以用于标记“自我”和“非我”，避免引起“误伤”；但是CD47也在各类肿瘤细胞表面高表达，发出“别吃我”信号，从而抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，实现免疫逃逸。因此该靶点也可以作为肿瘤治疗的有效靶点。
[0005]目前有一些关于人PD
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(L)1和CD47双靶点的专利，但是尚未有犬的PD
‑
(L)1和CD47双靶点的研究报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是为了提供针对犬的PD
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(L)1和CD47双靶点的融合蛋白，该融合蛋白适用于犬的过表达CD47和/或PD
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L1引起的疾病的治疗，且无血液毒性，安全性好。本专利技术还提供了编码如上所述的融合蛋白的核酸，一种含有所述融合蛋白的编码基因的生物材
料，一种用于生产如上所述的融合蛋白的制备方法，一种药物组合物，一种试剂盒，所述融合蛋白、核酸或生物材料在制备治疗犬类由过表达CD47和/或PD
‑
L1引起的疾病的药物中的应用。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术第一方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含犬PD
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1蛋白胞外区突变体和犬SIRPα蛋白。优选地，所述犬PD
‑
1蛋白胞外区突变体为犬PD
‑
1蛋白胞外区T132L。
[0008]优选地，所述融合蛋白包括Fc片段。
[0009]本专利技术第二方面提供编码如上所述的融合蛋白的核酸。
[0010]本专利技术第三方面提供一种含有如上所述融合蛋白的编码基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、转座子、载体或宿主细胞。
[0011]本专利技术第四方面提供一种用于生产如上所述的融合蛋白的制备方法，该方法包括在适合于所述融合蛋白表达的条件下培养如上所述的宿主细胞，然后从培养基中回收表达的融合蛋白。
[0012]本专利技术第五方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如上所述的融合蛋白，以及药学上可接受的载体和任选的其他治疗剂。
[0013]本专利技术第六方面提供一种试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的融合蛋白、如上所述的核酸或如上所述的生物材料。
[0014]本专利技术第七方面提供如上所述的融合蛋白、如上所述的核酸或如上所述的生物材料在制备治疗犬类由过表达CD47和/或PD
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L1引起的疾病的药物中的应用。
[0015]本专利技术所述的融合蛋白无血液毒性，安全性好，且能够同时与肿瘤细胞上的PD
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L1和CD47结合，抑制肿瘤细胞与T细胞和巨噬细胞的结合，从而促进T细胞激活和巨噬细胞的吞噬活性，达到杀伤肿瘤细胞的目的。
附图说明
[0016]图1示出了本专利技术所述的融合蛋白的结构示意图；
[0017]图2示出了本专利技术所述的融合蛋白的SDS
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PAGE电泳图，其中，A：6％变性电泳图；B：8％非变性电泳图；其中，1为犬PD
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1mu
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SIRPα
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Fc；2为犬SIRPα
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PD
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1mu
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Fc；3为犬PD
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1mu
‑
Fc
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SIRPα；4为犬SIRPα
‑
Fc
‑
PD
‑
1mu；5为犬PD
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1mu
‑
SIRPαmu
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Fc；6为犬SIRPαmu
‑
PD
‑
1mu
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Fc；7为犬PD
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1mu
‑
Fc
‑
SIRPαmu；8为犬SIRPαmu
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Fc
‑
PD
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1mu；
[0018]图3示出了融合蛋白的红细胞凝集试验结果；
[0019]图4示出了犬PD
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1mu
‑
SIRPα
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Fc和犬PD
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1mu
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含犬PD
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1蛋白胞外区突变体(PD
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1mu)和犬SIRPα蛋白。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述犬PD
‑
1蛋白胞外区突变体为犬PD
‑
1蛋白胞外区T132L；优选地，所述犬PD
‑
1蛋白胞外区突变体具有(a)如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；或(b)与SEQ ID NO：1具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、进一步优选至少99％同一性的且具有相同功能的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述犬SIRPα蛋白为犬SIRPα蛋白胞外区全长、截短体或其突变体；优选地，所述截短体为犬SIRPαD1区截短体；优选地，所述犬SIRPα蛋白具有(a)如SEQ ID NO：2
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4中任意一个所示的氨基酸序列；或(b)与SEQ ID NO：2
‑
4中任意一个具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、进一步优选至少99％同一性的且具有相同功能的氨基酸序列。4.根据权利要求1
‑
3中任意一项所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白还包括Fc片段；优选地，所述Fc片段为IgG型，更优选为IgG1亚型；优选地，所述Fc片段包含免疫球蛋白铰链区、CH2和CH3区；优选地，所述Fc片段具有(a)如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；或(b)与SEQ ID NO：5具有至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、进一步优选至少99％同一性的且具有相同功能的氨基酸序列。5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其中，从氨基端至羧基端，犬PD
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1mu、犬SIRPα蛋白和Fc片段的顺序依次为1)犬PD
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1mu、犬SIRPα蛋白和Fc片段；或2)犬SIRPα蛋白、犬PD
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1mu和Fc片段；或3)犬PD
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1mu、Fc片段和犬SIRPα蛋白；或4)犬SIRPα蛋白、Fc片段和犬PD
‑
1mu；优选地，从氨基端至羧基端，犬PD
‑
1mu、犬SIRPα蛋白和Fc片段的顺序依次为犬PD
‑
1mu、犬SIRPα蛋白和Fc片段；优选地，犬PD
‑
1mu、犬SIRPα蛋白和F...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗昊澍，段军叶，谭泽民，王浦卉，熊剑胜，
申请(专利权)人：北京伟杰信生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：