CD164融合蛋白及其应用制造技术

本文所述的发明专利技术为接有异源蛋白的CD164粘蛋白结构域融合蛋白，例如具有治疗功能的异源蛋白，并且有益于延长血清半衰期。还提供了使用本发明专利技术融合蛋白的方法。用本发明专利技术融合蛋白的方法。

【技术实现步骤摘要】
CD164融合蛋白及其应用
[0001]本申请是2021年11月8日提交的专利技术名称为“CD164融合蛋白及其应用”的申请号为202180009089.6的中国专利技术专利申请的分案申请。
[0002]专利技术背景
[0003]细胞表面粘蛋白是大型跨膜糖蛋白，参与保护呼吸道上皮免受病原感染，调节细胞信号转导和转录。与大型粘蛋白不同，CD164包含长度小于60个氨基酸的小粘蛋白结构域。截至目前，CD164中粘液蛋白结构域功能并未明确。缺失CD164基因的小鼠均存活，无明显表型。人CD164是一种具有粘附性的唾液化粘蛋白样的膜蛋白。它是一种I型膜蛋白，在组织中几乎无处不在，主要位于细胞内的核内体和溶酶体内(Ihrke 2000,Chan 2000)。功能分析表明，CD164可能在CD34+细胞对接骨髓基质组织过程中起辅助作用。CD164包含两个粘蛋白结构域(I和II)，由一个富含半胱氨酸的非粘蛋白结构域连接，接着是一个跨膜结构域和一个胞内结构域(Doyonnas 2000)。CD164的粘蛋白结构域I由37个氨基酸组成，理论上可在3个N
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链糖基化位点和9个O
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链糖基化位点上翻译后修饰。
[0004]几种抗粘蛋白结构域I的单克隆抗体可结合糖表位，阻止CD34+细胞附着在骨髓基质网织细胞上。CD164去唾液酸后，可减少CD34+细胞的附着，因此，像唾液酸修饰这样的末端糖基化可能对维持CD34+细胞的“干细胞样”特征很重要(Doyonnas 2000)。此外，CD164可能参与CXCR4信号相关的迁移反应(F或des 2007)。在另一种检测系统中，转染293T细胞产生的CD164 Fc融合蛋白，可抑制响应分化信号的多核肌管的形成(Lee等人，2001)。
[0005]在所有情况下，CD164的功能对唾液酸酶或O
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糖肽酶的处理均敏感，表明CD164的糖基化修饰是其介导细胞间信号转导结合所必需。
[0006]人CD164粘蛋白结构域II由56个氨基酸组成，理论上可在2个N
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链糖基化位点和23个O
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链糖基化位点上形成翻译后修饰。没有证据表明CD164粘蛋白结构域II的表位参与功能结合。相反，CD164转录本分析发现，缺失外显子4或外显子5的剪接变异体，移除了大部分CD164粘蛋白结构域II，但并未影响CD164的功能(Chan 2001)。因此，CD164的粘蛋白结构域II形成一个刷状茎，支撑由CD164粘蛋白的结构域I和半胱氨酸富集区组成的冠状结构，参与细胞间的相互作用。
[0007]CD164粘蛋白结构域I和II之间的半胱氨酸富集区含52个氨基酸，其中8个半胱氨酸残基可形成二硫键桥。该结构域还包含4个假定的N
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连接的糖基化位点，以及可能附加的O
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糖基化位点。
[0008]总的来说，如果CD164完全糖基化，其糖基化可以贡献70％的分子质量。从人骨髓细胞、CD34+纯化的脐血细胞、或培养的骨髓基质网状细胞中，可以观察到90kDa的糖基化CD164，证实在成熟形态的人CD164的174个氨基酸残基的多肽中具有明显糖基化修饰(Doyonnas 2000)。
[0009]专利技术概述
[0010]本专利技术的一个方面是提供了一种融合蛋白，包括:(1)一种多肽，其包含的氨基酸序列与序列SEQ ID NO:1或2至少有90％的一致，(2)异源多肽。
[0011]在某些实施例中，该多肽由编号为SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列组成。
[0012]在某些实施例中，(1)是(2)的C
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端。在本案例中，(1)是SEQ ID NO:2
[0013]在某些实施例中，(1)是(2)的
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N端。在本案例中，(1)是SEQ ID NO:1
[0014]在某些实施例中，融合蛋白进一步包括(3)，一个第二种多肽，包含的氨基酸序列与序列SEQ ID NO:1或2至少有90％的一致性，其中(1)和(3)分别包含SEQ ID NO:1或2中的不同序列。
[0015]在某些实施例中，SEQ ID NO:1多肽是与异源多肽的N端融合，SEQ ID NO:2的多肽与异源多肽的C端融合。
[0016]在某些实施例中，所述异种多肽是一种治疗多肽。
[0017]在某些实施例中，治疗性多肽的(人或小鼠)血清或循环半衰期至少比融合蛋白的半衰期短10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％。
[0018]在某些实施例中，异源多肽包括成纤维细胞生长因子21(FGF21)、促卵泡激素(FSH)、髓源性生长因子(MYDGF)、成纤维细胞生长因子结合蛋白3(FGFBP3)、利钠肽B、肠促胰酶肽、胰高血糖素样肽1(GLP
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1)、促性腺激素释放激素、肠促胰液素、亮乳素、恩福维肽、胰高血糖素、双伐卢定、血清激素、促肾上腺皮质激素四肽、胰岛素样生长因子(IGF)、甲状旁腺激素或胰淀素。
[0019]融合蛋白包括O和/或N链糖基化。
[0020]在某些实施例中，融合蛋白包括唾液化。
[0021]在某些实施例中，融合蛋白还包括(1)和(2)之间的连接肽。
[0022]在某些实施例中，融合蛋白中(1)是(2)的C
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端，(1)可以是SEQ ID NO:2，异源多肽为MYDGF或其功能片段。
[0023]在某些实施例中，融合蛋白的氨基酸序列与SEO ID NOs:3
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8的任何一个氨基酸序列至少有90％的一致性。
[0024]在某些实施例中，融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
[0025]本专利技术的另一方面提供了编码本专利技术中融合蛋白的多核苷酸。
[0026]在某些实施例中，多核苷酸经密码子优化后在目标宿主细胞中表达。
[0027]在某些实施例中，目标宿主细胞是人类细胞、啮齿动物细胞(如小鼠细胞)或非人类哺乳动物细胞。
[0028]本专利技术的另一方面提供了包含本专利技术中的多核苷酸的载体。
[0029]在某些实施例中，所述载体为表达载体。
[0030]在某些实施例中，载体是质粒。
[0031]本专利技术的另一方面提供了包含本专利技术中融合蛋白、本专利技术中多核苷酸、或本专利技术中载体的宿主细胞。
[0032]在某些实施例中，宿主细胞是组织培养细胞。
[0033]在某些实施例中，宿主细胞是CHO K
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1细胞(ATCC#CCL61)或CHO DG44细胞或CHO DXB
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11细胞、Namalwa细胞(e.g.,ATCC#CRL
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1432)、HeLa细胞(ATCC#CCL
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2)、HEK293细胞(ATCC#CCL
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1573)、WI
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38细胞(ATCC#CCL...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其包含：(1)包含与SEQ ID NO:1或2具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽，和(2)异源多肽，其中所述异源多肽为髓源性生长因子(MYDGF)。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述多肽由SEQ ID NO:1或2的氨基酸序列组成。3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其中(1)位于(2)的C
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末端，任选地，(1)是SEQ ID NO:2。4.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其中(1)位于(2)的N
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末端，任选地，(1)是SEQ ID NO:1。5.如权利要求1
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4中任何一项所述的融合蛋白，进一步包含(3)包含与SEQ IDNO:1或2具有至少90％同一性的氨基酸序列的第二种多肽，其中(1)和(3)每一种包含SEQ ID NO:1和2中的一个不同多肽。6.如权利要求1
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5中任一项所述的融合蛋白，其包含与所述异源多肽N
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端融合的SEQ ID NO:1的多肽和与所述异源多肽C
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端融合的SEQ ID NO:2的多肽。7.如权利要求1所述的融合蛋白，其中异源多肽的(人或小鼠)血清半衰期，比融合蛋白的半衰期低至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％或95％。8.如权利要求1
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7中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含O
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和/或N
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连接的糖基化。9.如权利要求1
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8中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含唾液酸化。10.如权利要求1
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9中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白进一步包含位于(1)和(2)之间的连接肽。11.如权利要求1
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10中任一项所述的融合蛋白，其中(1)位于(2)的C
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末端，并且(1)任选地是SEQ ID NO:2，并且所述异源多肽是MYDGF或其功能片段。12.如权利要求1
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11中任一项所述的融合蛋白，其中融合蛋白元件具有与SEQID NO:3具有至少90％同一性的氨基酸序列。13.如权利要求12所述的融合蛋白，其具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。14.一种编码权利要求1
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13中任一项所述的融合蛋白的多核苷酸。15.如权利要求14所述的多核苷酸，其密码子被优化以被在目标宿主细胞中表达。16.如权利要求15所述的多核苷酸，其中，所述目标宿主细胞是人细胞、啮齿动物细胞(例如小鼠细胞)或非人哺乳动物细胞。17.一种包含权利要求14
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16中任一项所述的多核苷酸的载体。18.如权利要求17所述的载体，其特征在于，所述载...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹鸿萍，杨美家，缪应花，纪庆超，
申请(专利权)人：江苏艾洛特医药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：