长效重组LH融合蛋白及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了重组LH融合蛋白，所述融合蛋白是指LH的α亚基、β亚基通过范德华力连接，并且可选的与长效化片段连接。所述LH融合蛋白可基于基因工程技术，利用真核表达系统制备得到。LH融合蛋白药效高于天然LH，且减少给药频率，可单次给药；可替代绒促性素(hCG)在动物繁殖生产中的使用。殖生产中的使用。殖生产中的使用。

【技术实现步骤摘要】
长效重组LH融合蛋白及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物医药和动物繁殖
，具体地说，涉及一种长效重组LH融合蛋白及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]促黄体素(LH)是一种促性腺激素，其中猪促黄体素(Porcine luteinizing hormone，简称pLH)，是由猪脑垂体分泌的一种促性腺激素，由α和β两个糖基化亚基以非共价键方式连接形成异二聚体。哺乳动物的α亚基均相同或相似，β亚基由121个左右的氨基酸组成，存在很大的差异，不但有激素间特异性，且还有种间特异性，是激素生物活性和免疫活性的决定因素，故将β亚基称为特异亚基，能与靶器官受体结合。
[0003]根据1959年Falck提出的“两细胞
‑
两促性腺激素”学说理论，促黄体素(LH)在卵泡发育过程中发挥着重要作用。在卵泡期刺激卵泡膜细胞合成雄激素，为雌激素的合成提供底物；排卵前使卵母细胞成熟并排卵，黄体期维持黄体功能。LH还在卵母细胞恢复减数分裂、前列腺素合成、孕酮合成等过程发挥重要的作用。在牛，猪方面已证实，pLH对雌性可促使卵巢血流加速，在促卵泡素作用的基础上引起卵泡排卵和促进黄体的形成；对雄性可刺激睾丸间质细胞合成和分泌睾酮。因此pLH对畜牧生产和经济动物繁殖具有重要价值。
[0004]动物繁殖领域中，牛、羊、鱼普遍使用人工合成的促黄体素释放激素(LH
‑
RH，也称GnRH)及其类似物、绒促性素(HCG)或猪垂体组织中提取的LH。GnRH及其类似物能促使动物垂体前叶释放高水平LH和低水平促卵泡素(FSH)；HCG与LH相似性较高，能结合相同的LH/HCG受体(LHCGR)发挥生物学效应，LH的半衰期短(30min左右)，临床使用中会被很快代谢，HCG的半衰期较长(2
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3天)，所以通常是通过HCG模拟LH峰，进行排卵诱导。
[0005]目前尚无重组兽用LH产品上市，畜用LH产品主要包括猪垂体提取的LH、人工合成的GnRH及其类似物和孕妇尿液中提取的HCG。猪垂体提取的LH，很难将猪FSH与LH分离造成纯化难度大、产能低、产品批次差异大，在实际应用中受到很大限制；人工合成的GnRH及其类似物作用于脑垂体促性腺细胞，刺激促黄体生成素LH和促卵泡刺激素FSH的合成与分泌，人工合成激素分子(式量，结构，元素等)与天然的不完全相同，长期大剂量的使用GnRH及其类似物会抑制排卵；孕妇尿液中提取的HCG可能引发卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)。
[0006]因此由于存在猪垂体LH半衰期较短、GnRH易产生不良效应、HCG可能引起卵巢过度刺激综合征等问题，并且现有的物质的动物广谱性不好，无法使用一种蛋白同时广泛在多物种中使用，因此动物繁殖领域特别是经济动物需要长效的动物源LH。

技术实现思路

[0007]为解决上述技术问题，本专利技术涉及一种融合蛋白，包括LHα亚基和LHβ亚基，所述LHα亚基和LHβ亚基连接方式为通过范德华力或连接元件进行连接。
[0008]所述LH的LHα亚基和LHβ亚基的来源可以为哺乳动物，包括但不限于猪、牛、羊、马、
兔、猴、狗、猫、鼠、鱼，进一步的，鼠可以是大鼠、小鼠。示例性的，可以采用猪LHα亚基氨基酸序列
[0009]FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTML VPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNARVENHTECHCSTCYYHKS(SEQ IDNO.1)
[0010]以及猪LHβ亚基氨基酸序列
[0011]SRGPLRPLCRPINATLAAENEACPVCITFTTSICAGYCPSMVRVLPAALPPVPQP
[0012]VCTYRELSFASIRLPGCPPGVDPTVSFPVALSCHCGPCRLSSSDCGGPRAQPLACDRPLLPGLLFL(SEQ ID NO.2)
[0013]本专利技术还进一步提供了表达上述蛋白的核苷酸序列，核苷酸序列为专利技术人经过研究物种偏好性、哺乳动物进化树、哺乳动物基因序列同源性比对，经过密码子优化获得的。示例性的：
[0014]猪LHα亚基核苷酸序列
[0015]tttcccgatggcgagttcaccatgcagggatgtcctgagtgcaaactgaaggagaacaagtactttagcaaactgggagcaccaatctaccagtgtatgggatgttgcttcagtagagcttatcccactccagctaggtccaagaagaccatgctggtgcctaagaacattaccagtgaggccacctgttgtgtggccaaggcattcaccaaagctactgtcatgggtaatgccagggtggagaaccataccgagtgccactgttctacatgttactaccacaaatct(SEQ ID NO.3)
[0016]猪LHβ亚基核苷酸序列
[0017]agcagaggtccactcagacctctgtgcagacccataaacgctacactcgcagccgagaacgaggcatgtcctgtgtgcatcaccttcactacttcaatttgtgctggctactgccctagcatggttagggttctcccagccgcactgcctcctgtgcctcagcccgtctgtacctatcgcgaactgagcttcgcttctatcaggctccctggctgtccaccaggcgtcgatcccactgtgtccttcccagttgccctcagctgtcactgcggaccttgtagactgtcctcctccgactgtggaggaccacgcgcacagcctctggcttgcgaccggccactgctgcctgggctgctgtttctg(SEQ ID NO.4)
[0018]本专利技术还提供了对于蛋白例如LH蛋白或LH融合蛋白进行长效化的方法，方法在于使用长效化片段连接在上述LHα亚基或LHβ亚基的N端或C端，直接或间接通过连接元件进行连接，所述连接元件可以是融合蛋白中通常使用的Linker，例如GSlinker，又例如(GGGGS)3，(GGGGS)4等；通过上述元件连接从而形成多种蛋白结构；所述长效化片段选自CTP、Fc、血清白蛋白等蛋白片段。优选的可以选择人、灵长类或马属哺乳动物绒毛膜促性腺激素的β亚基羧端肽CTP，蛋白结构包括但不限于(范德华力连接用“：”表示，
“‑”
表示化学键连接)LHα:LHβ
‑
CTP，LHβ:LHα
‑
CTP。
[0019]示例性的，CTP为人源序列，具体序列可以为SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO.5)
[0020]示例性的，融合蛋白pLH
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组LH蛋白，其特征在于，包括LHα亚基和LHβ亚基，所述LHα亚基和LHβ亚基连接方式为通过范德华力或连接元件进行连接。2.权利要求1所述的重组LH蛋白，其特征在于，还包括长效化片段，选自CTP、Fc、血清白蛋白中至少一种。3.权利要求2所述的重组LH蛋白，其结构优选为LHα亚基或LHβ亚基与长效化片段CTP连接；作为优选，所述CTP可以为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；所述CTP直接或间接通过连接元件进行连接。4.权利要求1或2或3所述的重组LH蛋白，所述LH的α亚基氨基酸序列为SEQ IDNO.1所示，所述LH的β亚基的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；所述LH的β亚基与长效化片段CTP构成的融合蛋白pLHβ
‑
CTP亚基的氨基酸序列为SEQ IDNO.6所示。5.权利要求4所述的重组LH蛋白，所述LH的α亚基的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，所述LH的β亚基的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示；所述LH的β亚基与长效化片段CTP构成的融合蛋白pLHβ
‑
CTP亚基的核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示。6.一种表达载体，能够表达权利要求5所述的核苷酸序列。7.一种稳定转染细胞系，能够转染权利要求6所述的表达载体。8.权利要求1
‑
5所述的重组LH蛋白、...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗昊澍，师磊，韩国，于金库，
申请(专利权)人：北京伟杰信生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：