AnnexinV-mCherry融合蛋白及细胞凋亡试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种AnnexinV

【技术实现步骤摘要】
AnnexinV
‑
mCherry融合蛋白及细胞凋亡试剂盒


[0001]本专利技术涉及细胞检测
，具体涉及AnnexinV
‑
mCherry融合蛋白及细胞凋亡试剂盒。

技术介绍

[0002]磷脂结合蛋白Annexin V是检测细胞凋亡的灵敏指标之一，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA碎片检测比较，使用Annexin V可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料合并使用，来区分凋亡细胞与死亡细胞。
[0003]常规Annexin V和荧光蛋白mCherry通过化学偶联反应的方式制备，需要进一步采用特定纯化工序对没有发生偶联反应的蛋白进行去除，也会导致原料的浪费，工艺稳定性较差，无法大规模生产。
[0004]另外，Annexin V偶联藻红蛋白PE也常用来检测细胞凋亡，但是在Annexin V与PE化学偶联过程中，Annexin V与PE连接位点随机，纯化后，也存在部分偶联产物因为连接位点阻碍Annexin V与磷脂酰丝氨酸结合。
[0005]PE在流式检测应用中会同时被488nm和561nm激光器激发，造成偶联蛋白与7
‑
AAD或者PI等经典核染料搭配时出现串色严重的问题，数据补偿难度较大。

技术实现思路

[0006]基于此，有必要提供一种AnnexinV
‑
mCherry融合蛋白及细胞凋亡试剂盒，该AnnexinV
‑
mCherry融合蛋白无需采用工艺复杂的化学偶联反应制备，且AnnexinV与磷脂酰丝氨酸结合位点不被阻碍，大规模工业化生产的成本更低，稳定性更好，且能够替代PE偶联蛋白与7
‑
AAD或者PI等经典核染料搭配用于流式细胞仪检测解决488nm荧光补充难度大的问题。
[0007]本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种AnnexinV
‑
mCherry融合蛋白，依次包括AnnexinV蛋白序列、柔性接头序列以及mCherry荧光蛋白序列。柔性接头序列为包含10～29个氨基酸的接头序列，优选含15个氨基酸的(G4S)3的接头序列，不干扰正常功能区结构或功能区间的接触。
[0009]在其中一些实施例中，AnnexinV
‑
mCherry融合蛋白还包括与AnnexinV蛋白序列连接的N端组氨酸标签序列，组氨酸标签氨基酸数量少，对目的蛋白的结构影响较小，且组氨酸有利于后续的亲和纯化。
[0010]本专利技术还提供编码上述AnnexinV
‑
mCherry融合蛋白的基因，序列如SEQ ID NO.1所示。
[0011]本专利技术还提供一种包含序列如SEQ ID NO.1所示的基因的大肠杆菌工程菌。
[0012]本专利技术还提供一种制备AnnexinV
‑
mCherry融合蛋白的方法，包括如下步骤：构建包含SEQ ID NO.1所示序列的大肠杆菌工程菌；诱导表达，破碎菌体，纯化，即得AnnexinV
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mCherry融合蛋白。
[0013]在其中一些实施例中，所述诱导表达的工艺条件为：0.1～1mM IPTG，37℃诱导表达3～6h。
[0014]在其中一些实施例中，在破碎菌体之前，还包括去除培养基并采用PBS缓冲液重悬菌体的步骤，所述破碎菌体的工艺参数为：超声破碎仪超声3s，停1～3s，功率20％～40％。
[0015]在其中一些实施例中，纯化的工艺步骤为：将破碎后的菌液离心，收集上清液；将所述上清液上样于Ni Focurose 6FF(IDA)填料柱，采用不同浓度的氯化钠磷酸溶液进行梯度洗脱，收集包含目标蛋白的洗脱成分；将包含目标蛋白的洗脱成分再上样Focudex G
‑
25柱进行脱盐，将脱盐后的洗脱成分再上样HiTrap Q HP柱再次进行纯化，得纯化后的AnnexinV
‑
mCherry融合蛋白。
[0016]本专利技术还可以提供一种细胞凋亡试剂盒，包含核酸染料以及上述AnnexinV
‑
mCherry融合蛋白。
[0017]在其中一些实施例中，所述核酸染料为7
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AAD。
[0018]本专利技术的有益效果是：
[0019]与现有的化学偶联技术相比，本专利技术首次提供具有氨基酸序列明确、单一、稳定性好的AnnexinV
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mCherry融合蛋白，可以利用大肠杆菌高效表达，大规模工业化生产的成本更低。该AnnexinV
‑
mCherry融合蛋白的AnnexinV与磷脂酰丝氨酸结合位点不被阻碍，批间应用时荧光信号均匀性好，488nm激发时荧光信号弱，便于进行荧光补偿，使下游结果分析更便捷可信。
附图说明
[0020]图1为实施例1的AnnexinV
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mCherry融合蛋白的序列组成示意图。
[0021]图2为实施例3的亲和柱洗脱后的SDS
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PAGE检测图；其中，泳道1对应破碎后沉淀，泳道2对应上样时流穿部分，泳道3对应PBS洗脱液洗脱成分，泳道4
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6对应PBS+50mM咪唑洗脱液洗脱成分，泳道7
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8对应PBS+100mM咪唑洗脱液洗脱成分，泳道9对应蛋白Marker洗脱成分，泳道10
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12对应PBS+300mM咪唑洗脱液洗脱成分，泳道13
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14对应PBS+500mM咪唑洗脱液洗脱成分。
[0022]图3为实施例3的HiTrap Q HP纯化后的A
280
检测图。
[0023]图4为实施例3最终纯化获得目的蛋白的SDS
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PAGE检测图；其中，MK对应蛋白Marker，R对应Annexin V
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mCherry融合蛋白。
[0024]图5为商业FITC
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AnnexinV/PI试剂盒针对细胞凋亡模型的流式检测图；其中，A对应凋亡细胞模型；B对应正常细胞模型。
[0025]图6为mCherry
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AnnexinV融合蛋白的浓度滴定结果统计图。
[0026]图7为7
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ADD的浓度滴定结果统计图。
[0027]图8为样本细胞数滴定结果统计图。
[0028]图9不同孵育染色时间对mCherry
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AnnexinV融合蛋白和7
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ADD的分离指数的影响
统计图；A本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种AnnexinV
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mCherry融合蛋白，其特征在于，依次包括AnnexinV蛋白序列、柔性接头序列以及mCherry荧光蛋白序列，所述柔性接头序列为包含10～29个氨基酸的接头序列。2.根据权利要求1所述的AnnexinV
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mCherry融合蛋白，其特征在于，还包括与AnnexinV蛋白序列连接的N端组氨酸标签序列。3.编码权利要求1或2所述AnnexinV
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mCherry融合蛋白的基因，其特征在于，基因序列如SEQ ID NO.1所示。4.一种编码权利要求1或2所述AnnexinV
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mCherry融合蛋白的基因的大肠杆菌工程菌。5.一种制备权利要求1或2所述AnnexinV
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mCherry融合蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：构建包含SEQ ID NO.1所示序列的大肠杆菌工程菌；诱导表达，破碎菌体，纯化，即得AnnexinV
‑
mCherry融合蛋白。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述诱导表达的...

【专利技术属性】
技术研发人员：冷毅斌，杨飞，左昌红，梅冬意，骆祚琴，
申请(专利权)人：伊莱瑞特武汉生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：