用于流式细胞术分析凋亡细胞的制造技术

本发明专利技术提供用于流式细胞术分析凋亡细胞的

【技术实现步骤摘要】
用于流式细胞术分析凋亡细胞的TUNEL专用固定破膜剂及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于流式细胞
，具体涉及用于流式细胞术分析凋亡细胞的
TUNEL
专用固定破膜剂及其制备方法与应用
。

技术介绍

[0002]细胞在发生凋亡时，会激活一些特异性的
DNA
内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组
DNA。
使得凋亡细胞的
DNA
被切割成
180
～
200bp
片段，细胞经过固定通透后，
TdT
酶
(
脱氧核糖核酸末端转移酶
)
将荧光标记的
dUTP
连接到细胞断裂
DNA
暴露的
3'
‑
OH
末端，通过在这些末端添加荧光
dUTP
的方式来标记晚期凋亡细胞，从而使凋亡细胞带上荧光，再通过荧光检测仪器即可检测到
DNA
断裂的凋亡细胞
。
[0003]TUNEL
作为细胞凋亡检测的金标准，根据检测仪器的不同分为2种，一种为原位
TUNEL
检测，主要是通过荧光显微镜对凋亡细胞的荧光信号进行拍照和采集，可应用于石蜡切片
、
冰冻切片
、
细胞爬片等样本的检测；一种为流式
TUNEL
检测，主要通过流式细胞术对单细胞悬液
(
如消化的贴壁细胞
>、
悬浮细胞
、
组织等的单细胞悬液
)
中凋亡细胞的荧光信号进行采集和分析
。
[0004]两种检测方法各有优劣，用于原位检测的
TUNEL
可以从细胞的亚细胞结构上直观的观察到凋亡基因的亚细胞定位，但无法解决凋亡细胞的定量分析，而细胞爬片的原位检测存在凋亡细胞容易脱落的问题无法解决，尤其是一些贴壁困难的细胞经过原位检测流程后，细胞脱落过多，导致检测结果的不准确和实验失败，且无法解决悬浮细胞的
TUNEL
检测；流式
TUNEL
可解决该问题
。
[0005]目前市场上的流式
TUNEL
检测试剂盒中只包含有染色标记液，平衡液，
TDT
酶这些染色标记成分
。
但对于细胞样本的处理细节比较模糊，而细胞样本的处理是
TUNEL
流式检测成败的关键，收集市场上用于流式检测的固定液和破膜液，经过测试，这些固定液和破膜液可以用于其他流式方法检测细胞蛋白抗原的固定和破膜，但不能满足用
TUNEL
方法检测断裂
DNA
的固定破膜需求
。
[0006]专利
CN115754305A
报道了一种专用于流式检测的细胞固定破膜剂及其使用方法
。
其公开的固定破膜液主要用于流式细胞术检测细胞内的蛋白类抗原抗体，经过测试，该固定破膜液不适用于
TUNEL
流式检测断裂的
DNA
对凋亡细胞进行标记的环境
。
[0007]专利
CN112229696A
同样报道了一种用于流式检测的细胞固定液及其使用方法，其应用同样的主要用于流式细胞术检测细胞内的蛋白类抗原抗体，经过测试，该固定破膜液也不适用于
TUNEL
流式检测断裂的
DNA
对凋亡细胞进行标记的环境
。
[0008]样本的处理作为实验的第一步，起着决定性的作用，
TUNEL
检测需要
TDT
酶和标记液穿透细胞外膜和细胞核膜，并在细胞核内
DNA
的水平上完成标记，目前市场上已有的固定液和破膜液，以及相关的固定液破膜液专利，均为针对细胞质内的蛋白检测的抗原抗体反应，不适用于细胞核内的
DNA
标记，针对
TUNEL
实验的特异性需求，需要开发一套可用于
TUNEL
检测
DNA
标记的专用固定破膜液，提高
TUNEL
实验的成功率和灵敏度
。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的在于，针对现有技术的上述不足，提供了用于流式细胞术分析凋亡细胞的
TUNEL
专用固定破膜剂及其制备方法与应用
。
[0010]为实现上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：
[0011]本专利技术的第一目的是提供一种用于流式细胞术分析凋亡细胞的
TUNEL
专用固定破膜剂，所述固定破膜液包括固定液和破膜液；按重量百分比计，所述固定破膜液包括固定液和破膜液；按重量百分比计，所述固定液包括戊二醛
0.1
～5％
、
多聚甲醛1％～
25
％
、
甲醇
0.5
％～
10
％
、
甘油
0.5
％～
10
％
、Triton X
‑
100 0.5
％～5％
、
氯化钠
0.1
％～3％
、
氯化钾
0.1
％～1％
、
磷酸二氢钾
0.1
％～1％
、
十二水磷酸氢二钠
0.1
％～2％和余量为水；按重量百分比计，所述破膜液包括
NP40 0.02
％～3％
、Triton X
‑
100 0.01
％～3％
、BSA0.2
％～
10
％
、
氯化钠
0.1
％～3％
、
氯化钾
0.1
％～1％
、
磷酸二氢钾
0.1
％～1％和二水合柠檬酸三钠
0.1
％～2％和余量为水
。
[0012]进一步的，所述固定液的
pH
为7～
7.6
，所述破膜液的
pH
为7～
7.6。
[0013]本专利技术的第二目的是提供上述的固定液的制备方法，包括以下步骤：包括以下步骤：将多聚甲醛溶解于纯水中，再依次称量并加入氯化钠
、
氯化钾
、
磷酸二氢钾
、
十二水合磷酸氢二钠，室温搅拌溶解，调整
PH
至
7.0
～
7.6
，然后加入甲醇溶液，边加边搅拌，待溶液混匀后再加入戊二醛液体
、
甘油和
Triton X
‑
100
，室温搅拌混匀，静置消除气泡后定容，即得所述固定本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于流式细胞术分析凋亡细胞的
TUNEL
专用固定破膜剂，其特征在于，所述固定破膜液包括固定液和破膜液；按重量百分比计，所述固定液包括戊二醛
0.1
～5％
、
多聚甲醛1％～
25
％
、
甲醇
0.5
％～
10
％
、
甘油
0.5
％～
10
％
、Triton X
‑
100 0.5
％～5％
、
氯化钠
0.1
％～3％
、
氯化钾
0.1
％～1％
、
磷酸二氢钾
0.1
％～1％
、
十二水磷酸氢二钠
0.1
％～2％和余量为水；按重量百分比计，所述破膜液包括
NP40 0.02
％～3％
、Triton X
‑
100 0.01
％～3％
、BSA0.2
％～
10
％
、
氯化钠
0.1
％～3％
、
氯化钾
0.1
％～1％
、
磷酸二氢钾
0.1
％～1％和二水合柠檬酸三钠
0.1
％～2％和余量为水
。2.
如权利要求1所述的固定破膜剂，其特征在于，所述固定液的
pH
为7～
7.6
，所述破膜液的
pH
为7～
7.6。3.
一种如权利要求1或2所述的固定液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将多聚甲醛溶解于纯水中，再依次称量并加入氯化钠
、
氯化钾
、
磷酸二氢钾
、
十二水合磷酸氢二钠，室温搅拌溶解，调整
PH
至
7.0
～
7.6
，然后加入甲醇溶液，边加边搅拌，待溶液混匀后再加入戊二醛液体
、
甘油和
Triton X
‑
100
，室温搅拌混匀，静置消除气泡后定容，即得所述固定液
。4.
一种如权利要求1或2所述的破膜液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：依次称量氯化钠
、
氯化钾
、...

【专利技术属性】
技术研发人员：冷毅斌，杨飞，乔琳琼，
申请(专利权)人：伊莱瑞特武汉生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：