一种肾脏组织石蜡切片中TRPC6蛋白的荧光染色方法技术

本发明专利技术公开了一种肾脏组织石蜡切片中TRPC6蛋白的荧光染色方法，涉及蛋白染色检测领域，包括如下步骤：S1：将肾脏组织病理切片在60℃恒温箱中烘烤30min；S2：将烘烤后的肾脏组织病理切片脱蜡水化；S3：使用EDTA修复液在恒温恒压下对脱蜡水化后的肾脏组织病理切片进行蒸煮，对抗原进行修复；S4：蒸煮后的切片冷却至室温后使用PBS缓冲液冲洗；S5：将肾脏组织病理切片表面PBS缓冲液甩离，使用免疫组化笔圈出需要染色的组织；本发明专利技术提供的对肾脏组织石蜡切片中TRPC6蛋白染色方法，通过蒸煮对抗原进行修复后染色，使得抗原暴露更充分，TRPC6作为膜蛋白在肾小球中的线性表达模式更清晰，TRPC6蛋白在肾小球中的位置关系及表达量信息更加准确。更加准确。更加准确。

【技术实现步骤摘要】
一种肾脏组织石蜡切片中TRPC6蛋白的荧光染色方法


[0001]本专利技术涉及蛋白染色检测领域，具体涉及一种肾脏组织石蜡切片中TRPC6蛋白的荧光染色方法。

技术介绍

[0002]糖尿病肾病(DN)是糖尿病的常见并发症,也是终末期肾病的主要病因之一。蛋白尿是DN最直接、最主要的表现，然而蛋白尿的出现与足细胞的损伤密切相关。DN的主要病理变化是肾小球基底膜增厚、肾小球细胞肥大和足细胞损伤及丢失。足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分,是保障肾小球滤过功能的关键。足细胞功能的正常发挥严重依赖胞内钙信号的处理,过量的Ca内流会导致足细胞足突融合、消失及细胞的凋亡,进一步导致肾小球的损伤。TRPC6蛋白是介导足细胞钙内流最关键的蛋白,其表达水平与DN等蛋白尿性肾脏疾病的发生发展密切相关。因此对肾脏组织中TRPC6蛋白的染色检测对肾损伤检测十分重要；现有技术中对TRPC6蛋白的染色检测方法采用常规的免疫荧光法；然而，这种该方法对肾脏组织石蜡切片染色得到的染色图中，抗原暴露不充分，无法清晰的体现TRPC6作为膜蛋白应具有的线性结构。

技术实现思路

[0003]针对现有技术的上述不足，本专利技术提供了一种TRPC6抗原暴露更充分，TRPC6蛋白更清晰的肾脏组织石蜡切片中TRPC6蛋白的荧光染色方法。
[0004]为达到上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案为：
[0005]提供一种肾脏组织石蜡切片中TRPC6蛋白的荧光染色方法，其包括如下步骤：
[0006]S1：将肾脏组织病理切片在60℃恒温箱中烘烤30min；
[0007]S2：将烘烤后的肾脏组织病理切片脱蜡水化；
[0008]S3：使用EDTA修复液在恒温恒压下对脱蜡水化后的肾脏组织病理切片进行蒸煮，对抗原进行修复；
[0009]S4：蒸煮后的切片冷却至室温后使用PBS缓冲液冲洗；
[0010]S5：将肾脏组织病理切片表面PBS缓冲液甩离，使用免疫组化笔圈出需要染色的组织；
[0011]S6：使用封闭液覆盖组织，放入湿盒中室温孵育1.5h；
[0012]S7：将肾脏组织病理切片表面封闭液甩离，使用TRPC6抗体覆盖组织，在4℃环境下孵育16
‑
18h；
[0013]S8：室温条件下复温30min后，将肾脏组织病理切片表面TRPC6抗体甩离后使用PBS缓冲液冲洗；
[0014]S9：将肾脏组织病理切片表面PBS缓冲液甩离，在避光环境下配制荧光二抗，使用荧光二抗覆盖组织，在避光、室温条件下孵育1h；
[0015]S10：将肾脏组织病理切片表面荧光二抗甩离后使用PBS缓冲液冲洗；
[0016]S11：使用DAPI染色液覆盖组织，在室温、避光的环境下孵育10min；
[0017]S12：将肾脏组织病理切片表面DAPI染色液甩离后使用PBS缓冲液冲洗；
[0018]S13：使用抗荧光淬灭剂的封片液封闭肾脏组织病理切片，完成切片染色。
[0019]进一步的，步骤S2包括如下具体步骤：
[0020]将烘烤后的肾脏组织病理切片依次进行如下操作：浸入二甲苯Ⅰ溶液中10min；浸入二甲苯Ⅱ溶液中10min；浸入100％酒精中5min；浸入90％酒精中5min；浸入85％酒精中5min；浸入80％酒精中5min；最后使用自来水冲洗2min。
[0021]进一步的，封闭液由山羊血清原液与PBS缓冲液以1:9的比例配制得到。
[0022]进一步的，TRPC6抗体由TRPC6抗体原液与抗体稀释液以1:100的比例配制得到。
[0023]进一步的，荧光二抗由荧光二抗原液与抗体稀释液以1:400的比例配制得到。
[0024]进一步的，DAPI染色液由DAPI染剂与双蒸水以1:1000的比例配制得到。
[0025]进一步的，PBS缓冲液冲洗的具体步骤包括：将切片放在盛有PBS缓冲液的免疫组化抗原修复盒中，以60
‑
80次/分钟的频率摇晃清洗5分钟，重复清洗三次。
[0026]进一步的，步骤S13包括如下具体步骤：将染色好的切片放置在载玻片上，使用移液枪吸取抗荧光淬灭剂覆盖切片，盖上盖玻片，并放置在4℃的环境下保存。
[0027]进一步的，步骤S3包括如下具体步骤：将脱蜡水化后的肾脏组织病理切片和EDTA修复液加入恒温恒压炉中，在150
‑
230kPa以及115℃
‑
125℃的条件下蒸煮，对抗原进行修复10min。
[0028]本专利技术的有益效果为：
[0029]本专利技术提供的对肾脏组织石蜡切片中TRPC6蛋白染色方法，通过蒸煮对抗原进行修复后染色，使得抗原暴露更充分，TRPC6作为膜蛋白在肾小球中的线性表达模式更清晰，TRPC6蛋白在肾小球中的位置关系及表达量信息更加准确。
附图说明
[0030]图1为本专利技术的流程示意图；
[0031]图2为本专利技术的方法染色得到的切片染色图；
[0032]图3为现有染色方法得到的切片染色图。
具体实施方式
[0033]下面对本专利技术的具体实施方式进行描述，以便于本
的技术人员理解本专利技术，但应该清楚，本专利技术不限于具体实施方式的范围，对本
的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本专利技术的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本专利技术构思的专利技术创造均在保护之列。
[0034]如图1所示，一种肾脏组织石蜡切片中TRPC6蛋白的荧光染色方法，其包括如下步骤：
[0035]S1：将肾脏组织病理切片在60℃恒温箱中烘烤30min；
[0036]S2：将烘烤后的肾脏组织病理切片脱蜡水化；
[0037]S3：使用EDTA修复液在恒温恒压下对脱蜡水化后的肾脏组织病理切片进行蒸煮，对抗原进行修复；具体实施时，EDTA修复液采用proteintech货号PR30002的50X EDTA抗原
修复液；
[0038]S4：蒸煮后的切片冷却至室温后使用PBS缓冲液冲洗；具体实施时，采用生工生物的PBS缓冲液；
[0039]S5：将肾脏组织病理切片表面PBS缓冲液甩离，使用免疫组化笔圈出需要染色的组织；
[0040]S6：使用封闭液覆盖组织，放入湿盒中室温孵育1.5h；
[0041]S7：将肾脏组织病理切片表面封闭液甩离，使用TRPC6抗体覆盖组织，在4℃环境下孵育16
‑
18h；
[0042]S8：室温条件下复温30min后，将肾脏组织病理切片表面TRPC6抗体甩离后使用PBS缓冲液冲洗；
[0043]S9：将肾脏组织病理切片表面PBS缓冲液甩离，在避光环境下配制荧光二抗，使用荧光二抗覆盖组织，在避光、室温条件下孵育1h；
[0044]S10：将肾脏组织病理切片表面荧光二抗甩离后使用PBS缓冲液冲洗；
[0045]S11：使用DAPI染色液覆盖组织，在室温、避光本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肾脏组织石蜡切片中TRPC6蛋白的荧光染色方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：将肾脏组织病理切片在60℃恒温箱中烘烤30min；S2：将烘烤后的肾脏组织病理切片脱蜡水化；S3：使用EDTA修复液在恒温恒压下对脱蜡水化后的肾脏组织病理切片进行蒸煮，对抗原进行修复；S4：蒸煮后的切片冷却至室温后使用PBS缓冲液冲洗；S5：将肾脏组织病理切片表面PBS缓冲液甩离，使用免疫组化笔圈出需要染色的组织；S6：使用封闭液覆盖组织，放入湿盒中室温孵育1.5h；S7：将肾脏组织病理切片表面封闭液甩离，使用TRPC6抗体覆盖组织，在4℃环境下孵育16
‑
18h；S8：室温条件下复温30min后，将肾脏组织病理切片表面TRPC6抗体甩离后使用PBS缓冲液冲洗；S9：将肾脏组织病理切片表面PBS缓冲液甩离，在避光环境下配制荧光二抗，使用荧光二抗覆盖组织，在避光、室温条件下孵育1h；S10：将肾脏组织病理切片表面荧光二抗甩离后使用PBS缓冲液冲洗；S11：使用DAPI染色液覆盖组织，在室温、避光的环境下孵育10min；S12：将肾脏组织病理切片表面DAPI染色液甩离后使用PBS缓冲液冲洗；S13：使用抗荧光淬灭剂的封片液封闭肾脏组织病理切片，完成切片染色。2.根据权利要求1所述的肾脏组织石蜡切片中TRPC6蛋白的荧光染色方法，其特征在于，所述步骤S2包括如下具体步骤：将烘烤后的肾脏组织病理切片依次进行如下操作：浸入二甲苯Ⅰ溶液中10min；浸入二甲苯Ⅱ溶液中10min；浸入100％酒精中5min；浸入90％酒精中5min；浸入85％酒精中5min；浸入80％酒精中5min；最后使用自来水冲洗...

【专利技术属性】
技术研发人员：李秋，朱诗佳，杨雪影，肖寒，阳海平，江为，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属儿童医院，
类型：发明
国别省市：