一种重组融合蛋白生产多肽的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种重组融合蛋白生产多肽的方法，公开了一种由多个蛋白酶酶切位点与多肽序列按特定顺序串联组合，在蛋白伴侣的辅助下生产多肽的方法及其应用。本发明专利技术构建的高串联数重组工程菌，可以高效表达可溶的重组蛋白，不形成包涵体且杂蛋白少，经高压破碎后捕获的融合蛋白，在1

【技术实现步骤摘要】
一种重组融合蛋白生产多肽的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地说涉及一种重组融合蛋白生产多肽的方法及其应用。

技术介绍

[0002]多肽是由氨基酸以肽键形式连接在一起而形成的一类化合物，多肽普遍存在于生物体内，迄今为止，在生物体内发现的各类多肽已达数万种，其广泛参与和调节机体内各系统、器官、组织和细胞的功能活动，在生命活动中发挥重要作用。近些年，多肽药物作为国内外生物医药创新研发的重点领域，一直保持良好的发展前景。多肽药物在全球生物医药市场中占比较小，但发展迅速，2019年全球多肽药物市场规模突破300亿美元，年均复合增长率保持在10％左右。
[0003]随着蛋白质组学的研究深入，对多肽合成的要求越来越高，合成肽序越来越长，这就对多肽合成技术提出了更高的要求。常见的多肽药物可以是天然提取的、化学合成的，也可以是通过基因工程法获得的。
[0004]本专利技术中所涉及到多肽是一种人胰高血糖素样肽
‑
1(GLP
‑
1)类似物，是诺和诺德公司研发能够大幅改善2型糖尿病患者血糖水平的周制剂。化学合成该多肽方法通常采用固相偶联缩合方法，反应效率相对较低、纯化难度高、成本偏高。
[0005]基因工程方法一般在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。微生物表达系统具有培养简单，周期性短，成本低等优点，是商业性蛋白重要的表达来源。常用的微生物表达宿主有大肠杆菌、枯草杆菌、酵母等。原核表达的表达产物效率高、比较稳定，不易被宿主降解且由于大肠杆菌增殖时间较短、培养成本低廉，因此大肠杆菌表达系统成为一种较为快捷获取异源蛋白的方式。
[0006]融合蛋白表达是蛋白表达中常用的策略，将两个或多个基因的编码区首尾连接，然后由同一调控序列控制，从而目的蛋白融合表达的效率高、降解少、纯化简单方便。另外还可以利用构建于融合表达载体中的化学试剂断裂位点或蛋白酶切位点，在体外去除融合蛋白的原核肽段，从而得到天然蛋白产物。目前较为广泛使用的融合表达系统有PA系统、PG系统、His融合系统、GST系统、FLAG系统、MBP系统、TrxA融合系统等。融合表达不仅可以提高蛋白表达量，还可以帮助目的蛋白正确折叠，从而获得可溶蛋白。通常为了充分发挥宿主菌株的潜能，会串联多个目标蛋白进行表达，但是随着目标蛋白串联数量增多，融合蛋白分子量增大，满足高串联度融合蛋白可溶性高表达量的需要会愈加困难。
[0007]现有技术CN101910193A公开了GLP
‑
1类似物的制备方法，其使用酿酒酵母作为表达宿主，提供了可生物合成的GLP
‑
1类似物肽的生产方法。不足之处是：(1)酵母本身发酵周期长，成本较大肠杆菌要高；(2)虽然优化了GLP
‑
1类似物肽的表达系统，使得酿酒酵母自身的Kex2蛋白酶更易切割以便得到GLP
‑
1类似物肽，但每种类似物肽的表达都是以单个多肽序列的形式插入至表达载体中进行表达，因此限制了表达宿主的潜能。(3)在通过酵母自身释放的Kex2蛋白酶酶切后产生的GLP
‑
1类似物肽也无可避免地在N端和C端含有突出端，还
需要额外的酶切处理。
[0008]现有技术CN110128521A使用大肠杆菌作为表达宿主，公开了一种辅助蛋白用于生产重组融合蛋白，即辅助蛋白串联肠激酶的酶切位点和GLP
‑
1类似物。该技术中虽表达出可溶性融合蛋白，但该融合蛋白只包含一个目标多肽单元，随着目标多肽串联数量增多，辅助蛋白需要有促表达和助溶两个功能，有些辅助蛋白无法满足高串联度融合蛋白可溶性表达的需要。对于串联的多个目标多肽，尚需要开发能够保证可溶性高表达量的表达手段。
[0009]现有技术CN110305223A公开了一种融合蛋白包括串联的多个目标蛋白序列，融合蛋白在Kex2、CPB蛋白酶的作用下形成多个游离目标蛋白，实现了4个GLP
‑
1类似物串联表达。但相邻两个GLP
‑
1类似物多肽之间仅依靠“KR”连接，仅有4个“KR”酶切位点的融合蛋白需要过夜酶切而得到游离目标蛋白，严重影响了酶切速率。另外，该技术中融合蛋白虽有“EEAEAEARG”促进肽，还是无法避免有较多不可溶融合蛋白的产生。
[0010]因此，本领域需要开发一种便捷高效的多肽序列生产系统。

技术实现思路

[0011]本专利技术的目的就是提供一种重组融合蛋白生产多肽的方法及其应用。
[0012]在本专利技术的第一方面，提供了一种重组融合蛋白，其包括相互连接的：
[0013]a)蛋白伴侣，所述蛋白伴侣为硫氧还蛋白；
[0014]b)串联的n个目标多肽；
[0015]c)蛋白酶识别序列，所述蛋白酶识别序列用于将所述重组融合蛋白通过蛋白酶切割为n个独立目标多肽，
[0016]其中，n为2
‑
20的整数，优选为3
‑
15，更优选为5
‑
10。
[0017]在另一优选例中，所述的重组融合蛋白从N端到C端具有依次连接的：
[0018]蛋白伴侣
‑
{N端蛋白酶识别序列
‑
目标多肽
‑
C端蛋白酶识别序列
‑
连接肽}
n
‑1‑
N端蛋白酶识别序列
‑
目标多肽。
[0019]在另一优选例中，所述的硫氧还蛋白来自于温泉菌，优选为Pyrodictium occultum菌株、Hyperthermus butylicus菌株、Pyrolobus fumarii菌株、或Aeropyrum pernix K1菌株。
[0020]在另一优选例中，所述的硫氧还蛋白选自下组:
[0021](1)氨基酸序列如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、或SEQ ID NO:18所示；
[0022](2)与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、或SEQ ID NO:18具有至少80％以上、或至少85％以上、或至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或以上氨基酸序列同一性且具有促进融合蛋白可溶性功能的蛋白。
[0023]在另一优选例中，所述的N端蛋白酶识别序列为可被选自下组的蛋白酶识别并切割的序列：肠激酶(Enteropeptidase)、凝血酶(Thrombin)、SUMO蛋白酶、TEV蛋白酶、Factor Xa蛋白酶、或其组合。
[0024]在另一优选例中，所述的N端蛋白酶识别序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、或SEQ ID NO:5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组融合蛋白，其特征在于，包括相互连接的：a)蛋白伴侣，所述蛋白伴侣为硫氧还蛋白；b)串联的n个目标多肽；c)蛋白酶识别序列，所述蛋白酶识别序列用于将所述重组融合蛋白通过蛋白酶切割为n个独立目标多肽，其中，n为2
‑
20的整数，优选为3
‑
15，更优选为5
‑
10。2.如权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述的硫氧还蛋白选自下组：(1)氨基酸序列如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:16、或SEQ ID NO:18所示；(2)与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、或SEQ ID NO:18具有至少80％以上、或至少85％以上、或至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或以上氨基酸序列同一性且具有促进融合蛋白可溶性功能的多肽。3.如权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述的重组融合蛋白从N端到C端具有依次连接的：蛋白伴侣
‑
{N端蛋白酶识别序列
‑
目标多肽
‑
C端蛋白酶识别序列
‑
连接肽}
n
‑1‑
N端蛋白酶识别序列
‑
目标多肽。4.如权利要求3所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述的N端蛋白酶识别序列为可被选自下组的蛋白酶识别并切割的序列：肠激酶(Enteropeptidase)、...

【专利技术属性】
技术研发人员：李岩，李洁萍，黄美群，
申请(专利权)人：广东省卓肽医药有限公司，
类型：发明
国别省市：