CD5和CD7双靶点的全人源嵌合抗原受体(CAR)及其应用制造技术

本文提供了靶向CD5和/或CD7的CAR和表达靶向CD5和/或CD7的CAR的宿主细胞，以及它们的制备方法和在治疗T细胞相关肿瘤方面的应用。制备方法和在治疗T细胞相关肿瘤方面的应用。制备方法和在治疗T细胞相关肿瘤方面的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】CD5和CD7双靶点的全人源嵌合抗原受体(CAR)及其应用
[0001]相关申请的交叉援引
[0002]本申请要求申请号为CN202110904143.5、申请日为2021年8月6日、专利技术名称为“CD5和CD7双靶点的全人源嵌合抗原受体(CAR)及其应用”的中国专利技术专利申请的优先权，在此通过引用将其全文并入本文。


[0003]本申请涉及生物医药领域，具体涉及靶向CD5和CD7的CAR和表达靶向CD5和CD7的CAR的宿主细胞，以及它们的制备方法和应用。

技术介绍

[0004]T细胞恶性肿瘤包括急性T淋巴细胞白血病(T
‑
ALL)及T细胞淋巴瘤(TCL)。T
‑
ALL是T淋巴细胞异常增生造成的血液疾病，具有侵袭性并且进展迅速。T细胞淋巴瘤是T细胞的一种恶性肿瘤，可在淋巴组织(如淋巴结和脾脏)中或在淋巴组织之外(如胃肠道，肝脏，鼻腔，皮肤等)发展，约占非霍奇金淋巴瘤10％～15％，在我国比例更高。T细胞恶性肿瘤复发率和死亡率高，目前尚无有效或靶向的治疗方法。尽管目前已有多种多药联合化疗方案，但只有不到50％的成人和75％的儿童患有T
‑
ALL的患者存活5年以上。同种异体干细胞移植是唯一的治疗方法，但其存在一定的风险以及细胞毒性。目前，嵌合抗原受体T细胞(CAR
‑
T)技术在靶向治疗B细胞白血病和淋巴瘤患者中显示出极大的潜力
[1
‑
5]，可以诱导缓解，甚至在患者体内长期作用并大幅度降低复发几率。尽管CAR
‑
T疗法在B细胞恶性肿瘤治疗领域取得了巨大的成功，但其在T细胞恶性肿瘤的研究及应用十分有限，鲜有研究评价CAR
‑
T对T细胞恶性肿瘤的治疗作用。针对T细胞恶性肿瘤的CAR
‑
T疗法仍有很多挑战，目前还没有一种肿瘤特异性抗原被证实在肿瘤T细胞上有普遍表达，T细胞恶性肿瘤常有异质性，与T细胞恶性肿瘤治疗后复发高度相关。
[0005]CD5和CD7是靶向T细胞恶性肿瘤治疗的两个有潜力的靶点
[6]。许多T细胞恶性肿瘤表达CD7，这为T细胞癌的免疫治疗提供了一个有吸引力的靶点。但正常的T细胞，包括那些用来设计CAR
‑
T的细胞，也表达CD7。由于大多数T
‑
NHL和T
‑
ALL高表达CD7，且除了T细胞恶性肿瘤，CD7在约24％的AML中表达，被认为是白血病干细胞的标记物，并在绝大多数自然杀伤细胞(NK)和NKT NHLs和白血病中表达
[7]。CD5是一种泛T细胞标记物，在大多数T细胞恶性肿瘤中普遍过表达
[8]。正常细胞CD5的表达仅限于胸腺细胞、外周T细胞和少量的B淋巴细胞亚群，称为B
‑
1细胞。此外，CD5是T细胞受体(TCR)信号的负调节因子，并在保护自身免疫中发挥作用
[9]。

技术实现思路

[0006]在一方面，本文提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其抗原结合结构域能够至少特异性结合CD5和/或CD7。
[0007]在一些实施方案中，所述抗原结合结构域包括：
[0008]1)能够特异性结合CD5的第一抗体或其抗原结合片段；和/或
[0009]2)能够特异性结合CD7的第二抗体或其抗原结合片段；以及
[0010]3)可选地，能够特异性结合不同于CD7和CD5的另一抗原的第三抗体或其抗原结合片段。
[0011]在一些实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段和/或所述第二抗体或其抗原结合片段和/或所述第三抗体或其抗原结合片段为单链抗体(scFv)或单域抗体(sdAb)。
[0012]在一些实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段与所述第二抗体或其抗原结合片段之间通过肽接头串联连接；优选地，所述肽接头包括SEQ ID NO：26所示氨基酸序列。
[0013]在一些实施方案中，所述抗原结合结构域从氨基端到羧基端方向包括：所述第一抗体或其抗原结合片段、所述肽接头和所述第二抗体或其抗原结合片段；或者所述第二抗体或其抗原结合片段、所述肽接头和所述第一抗体或其抗原结合片段。
[0014]在一些实施方案中，所述第一抗体和/或第二抗体为全人源抗体。
[0015]在一些实施方案中，所述第一抗体或其抗原结合片段包括重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包括SEQ ID NO：31所示氨基酸序列、所述HCDR2包括SEQ ID NO：32所示氨基酸序列以及所述HCDR3包括SEQ ID NO：33所示氨基酸序列。
[0016]在一些实施方案中，所述第二抗体或其抗原结合片段包括重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包括SEQ ID NO：34所示氨基酸序列、所述HCDR2包括SEQ ID NO：35所示氨基酸序列以及所述HCDR3包括SEQ ID NO：36所示氨基酸序列。
[0017]在一些实施方案中，所述第一抗体包括SEQ ID NO：28所示氨基酸序列或其功能性变体。
[0018]在一些实施方案中，所述第二抗体包括SEQ ID NO：30所示氨基酸序列或其功能性变体。
[0019]在一些实施方案中，所述抗原结合结构域包括SEQ ID NO：38或40所示氨基酸序列或其功能性变体。
[0020]在一些实施方案中，所述CAR还包括信号肽、胞外铰链区、跨膜区、胞内共刺激结构域和胞内信号传导结构域中的任意一种或其组合。
[0021]在一些实施方案中，所述信号肽、所述胞外铰链区和所述跨膜区来自CD8α；所述胞内共刺激结构域来自4
‑
1BB胞内结构域；以及所述胞内信号传导结构域来自CD3ζ。
[0022]在一些实施方案中，所述信号肽包括SEQ ID NO：2所示氨基酸序列、所述胞外铰链区包括SEQ ID NO：4所示氨基酸序列、所述跨膜区包括SEQ ID NO：6所示氨基酸序列、所述胞内共刺激结构域包括SEQ ID NO：8所示氨基酸序列以及所述胞内信号传导结构域包括SEQ ID NO：10所示氨基酸序列。
[0023]在一些实施方案中，所述CAR还包括自剪切肽和截短形式的EGFR分子(tEGFR)。
[0024]在一些实施方案中，所述自剪切肽为T2A肽，优选包括SEQ ID NO：12所示氨基酸序列；所述tEGFR包括SEQ ID NO：16所示氨基酸序列。
[0025]在一些实施方案中，所述CAR包括SEQ ID NO：20或22所示氨基酸序列或其功能性变体。
[0026]另一方面，本文提供了核酸分子，其编码上述CAR或其片段。
[0027]在一些实施方案中，上述核酸分子包括SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、
21、25、27、29、37和39中任一项所示核苷酸序列或其简并变体。
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.嵌合抗原受体(CAR)，其抗原结合结构域能够至少特异性结合CD5和/或CD7。2.如权利要求1所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包括：1)能够特异性结合CD5的第一抗体或其抗原结合片段；和/或2)能够特异性结合CD7的第二抗体或其抗原结合片段；以及3)可选地，能够特异性结合不同于CD7和CD5的另一抗原的第三抗体或其抗原结合片段。3.如权利要求1或2所述的CAR，其中所述第一抗体或其抗原结合片段和/或所述第二抗体或其抗原结合片段和/或所述第三抗体或其抗原结合片段为单链抗体(scFv)或单域抗体(sdAb)。4.如权利要求1
‑
3任一项所述的CAR，其中所述第一抗体或其抗原结合片段与所述第二抗体或其抗原结合片段之间通过肽接头串联连接；优选地，所述肽接头包括SEQ ID NO：26所示氨基酸序列。5.如权利要求1
‑
4任一项所述的CAR，其中所述抗原结合结构域从氨基端到羧基端方向包括：所述第一抗体或其抗原结合片段、所述肽接头和所述第二抗体或其抗原结合片段；或者所述第二抗体或其抗原结合片段、所述肽接头和所述第一抗体或其抗原结合片段。6.如权利要求1
‑
5任一项所述的CAR，其中所述第一抗体和/或第二抗体为全人源抗体。7.如权利要求1
‑
6任一项所述的CAR，其中所述第一抗体或其抗原结合片段包括重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包括SEQ ID NO：31所示氨基酸序列、所述HCDR2包括SEQ ID NO：32所示氨基酸序列以及所述HCDR3包括SEQ ID NO：33所示氨基酸序列。8.如权利要求1
‑
7任一项所述的CAR，其中所述第二抗体或其抗原结合片段包括重链互补决定区1(HCDR1)、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包括SEQ ID NO：34所示氨基酸序列、所述HCDR2包括SEQ ID NO：35所示氨基酸序列以及所述HCDR3包括SEQ ID NO：36所示氨基酸序列。9.如权利要求1
‑
8任一项所述的CAR，其中所述第一抗体包括SEQ ID NO：28所示氨基酸序列或其功能性变体。10.如权利要求1
‑
9任一项所述的CAR，其中所述第二抗体包括SEQ ID NO：30所示氨基酸序列或其功能性变体。11.如权利要求1
‑
10任一项所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包括SEQ ID NO：38或40所示氨基酸序列或其功能性变体。12.如权利要求1
‑
11任一项所述的CAR，其中所述CAR还包括信号肽、胞外铰链区、跨膜区、胞内共刺激结构域和胞内信号传导结构域中的任意一种或其组合。13.如权利要求1
‑
12任一项所述的CAR，其中所述信号肽、所述胞外铰链区和所述跨膜区来自CD8α；所述胞内共刺激结构域来自4
‑
1BB胞内结构域；以及所述胞内信号传导结构域来自CD3ζ。14.如权利要求1
‑
10任一项所述的CAR，其中所述信号肽包括SEQ ID NO：2所示氨基酸序列、所述胞外铰链区包括SEQ ID NO：4所示氨基酸序列、所述跨膜区包括SEQ ID NO：6所
示氨基酸序列、所述胞内共刺激结构域包括SEQ ID NO：8所示氨基酸序列以及所述胞内信号传导结构域包括SEQ ID NO：10所示氨基酸序列。15.如权利要求1
‑
10任一项所述的CAR，还包括自剪切肽和截短形式的EGFR分子(tEGFR)。16.如权利要求1
‑
14任一项所述的CAR，其中所述自剪切肽为T2A肽，优选包括SEQ ID NO：12所示氨基酸序列；所述tEGFR包括SEQ ID NO：16所示氨基酸序列。17.如权利要求1
‑
14任一项所述的CAR，其中所述CAR包括SEQ ID NO：20或22所示氨基酸序列或其功能性变体。18.核酸分子，其编码权利要求1
‑
17任一项所述的CAR或其片段。19.如权利要求18所述的核酸分子，其包括SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、25、27、29、37和39中任一项所示核苷酸序列或其简并变体。20.包括权利要求18或19所述的核酸分子的表达载体。21.制备表达权利要求1
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17任一项所述的CAR的宿主细胞的方法，包括将权利要求18或19所述的核酸分子或权利要求20所述的表达载体引入所述宿主细胞。22.如权利要求21所述的方法，还包括对所述宿主细胞的CD5和/或CD7基因进行基因敲除。23.如权利要求21或22所述的方法，其中所述基因敲除采用CRISPR技术进行，对CD5基因的基因敲除采用包括SEQ ID NO：45所示序列的sgRNA，对CD7基因的基因敲除采用包括SEQ ID NO：46所示序列的sg...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴振宇，谭涛超，周剑峰，赵雅，魏巧娥，贾向印，刘建伟，
申请(专利权)人：上海驯鹿生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：