一种纯化融合蛋白的方法技术

本发明专利技术提供了一种纯化融合蛋白的方法，包括以下步骤：步骤1，处理层析填料，上样；步骤2，使用平衡缓冲液淋洗；步骤3，使用洗脱缓冲液洗脱产品，并收集产品。本发明专利技术通过改进纯化条件，对添加剂种类、添加剂浓度、洗脱pH的考量和筛选，得到了合适的纯化工艺，使得融合蛋白中去除多聚体的效果较好，最终得到了纯度高、稳定性好的融合蛋白，有利于提高产品的质量控制水平、药物稳定性。药物稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种纯化融合蛋白的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种有效提纯多功能融合蛋白，减少多聚体杂质的纯化工艺。

技术介绍

[0002]多聚体是指抗体蛋白以二聚体或多聚体形式存在的聚集体。多聚体主要在细胞培养、蛋白纯化、制剂处方和药物储存的工艺过程中由于受培养工艺、纯化条件以及制剂存储过程中某些因素的影响，从而导致蛋白质部分分解折叠或者错误折叠，暴露的相关区域相互作用引发聚集，形成多聚体。
[0003]多聚体不仅可能会使得药物活性降低甚至失去生物活性，从而影响药效，更有可能使得受体发生过敏性免疫原反应，从而影响了受体的健康。因此，多聚体是抗体蛋白类药物在制备过程中需要监控和去除的杂质，药物中的多聚体含量被认为是产品的一个重要的质量指标。
[0004]在抗体融合蛋白药物生产的过程中，虽然我们可以通过改变操作条件，来控制多聚体的产生，但是我们没有办法达到产品中完全没有多聚体的控制效果。所以有效的多聚体的去除手段对于多聚体的控制就显得至关重要。
[0005]目前抗体融合蛋白类药物去除多聚体的纯化工艺，主要包括凝胶过滤层析、亲和层析、离子层析和疏水层析，其中亲和层析作为最主要的纯化方法，在洗脱过程中最常用的是线性洗脱法。一般的线性洗脱法的效果优于等度洗脱法。然而，线性洗脱法也存在一定的弊端，由于涉及到产品的分管收集，在生产过程中收集产品繁琐，可操作性不高。另外，在实际生产过程中，线性梯度的条件也不容易操作，导致不适合工业化生产。

技术实现思路

[0006]为了克服这一技术难题，本专利技术对抗体融合蛋白的纯化工艺进行了优化，在洗脱步骤中考察了不同的层析填料，不同的洗脱方式，不同的洗脱缓冲液对去除多聚体的影响，筛选出了合适的添加剂种类、添加剂浓度和最优的洗脱pH，最终开发出了最优的等度洗脱法，从而筛选出了合适的纯化工艺，使得在融合蛋白中去除多聚体的效果显著提高，且操作简单，适合工业化生产。
[0007]具体而言，本专利技术公开了一种纯化融合蛋白的方法，包括以下步骤：
[0008]步骤1，处理层析填料，上样；
[0009]步骤2，使用平衡缓冲液淋洗；
[0010]步骤3，使用洗脱缓冲液洗脱产品，并收集产品。
[0011]进一步地，所述洗脱缓冲液包含NaAc
‑
HAc、Tris
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盐酸、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液中的一种或几种。
[0012]进一步地，所述洗脱缓冲液还包含添加剂。
[0013]进一步地，所述添加剂选自氨基酸、醇、糖、盐中的一种或多种。
[0014]进一步地，所述氨基酸为精氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸中的一种或几种。
[0015]进一步地，所述盐选自NaCl和CaCl2的一种或两种。
[0016]进一步地，所述添加剂的浓度为10
‑
200mM，优选为20
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100mM，更优选为30
‑
80mM，进一步优选为40mM、50mM、60mM或70mM。
[0017]进一步地，所述洗脱方法为等度洗脱法或线性洗脱法。
[0018]进一步地，所述洗脱方法为等度洗脱法。
[0019]进一步地，所述洗脱缓冲液包含洗脱缓冲液1和洗脱缓冲液2。
[0020]进一步地，所述洗脱缓冲液1的pH为3.0
‑
5.0，优选为3.5
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4.5，更优选为3.9
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4.1，进一步优选为3.9、4.0或4.1。
[0021]进一步地，所述层析填料选自纳微Nanoab50HC、JSR A3、MabselectSuRe LX和博格隆AT Protein A Diamond中的一种或几种。
[0022]进一步地，步骤1为用3
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5倍柱体积缓冲液A(10
‑
30mM PB，120
‑
160mM NaCl，pH为7.2
‑
7.6)以流速1.0
‑
1.4mL/min冲洗平衡层析柱，用培养基上清液以流速1.0
‑
1.4mL/min进行上样，上样体积为40
‑
44mL。
[0023]进一步地，步骤1为用4倍柱体积缓冲液A(20mM PB，140mM NaCl，pH7.4)以流速1.2mL/min冲洗平衡层析柱，用培养基上清液以流速1.2mL/min进行上样，上样体积为42mL。
[0024]进一步地，步骤2为先用1
‑
3倍柱体积缓冲液A(10
‑
30mM PB，120
‑
160mM NaCl，pH为7.2
‑
7.6)以流速1.0
‑
1.4mL/min冲洗，然后用2
‑
4倍柱体积缓冲液C(20
‑
30mM NaAc
‑
HAc，450
‑
550mM NaCl，pH为4.8
‑
5.2)以流速1.0
‑
1.4mL/min冲洗，最后用2
‑
4倍柱体积缓冲液D
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2(40
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60mM NaAc
‑
HAc，pH为4.8
‑
5.2)以流速1.0
‑
1.4mL/min冲洗。
[0025]进一步地，步骤2为先用2倍柱体积缓冲液A(20mM PB，140mM NaCl，pH7.4)以流速1.2mL/min冲洗，然后用3倍柱体积缓冲液C(25mM NaAc
‑
HAc，500mM NaCl，pH5.0)以流速1.2mL/min冲洗，最后用3倍柱体积缓冲液D
‑
2(50mM NaAc
‑
HAc，pH5.0)以流速1.2mL/min冲洗。
[0026]进一步地，步骤3使用等度洗脱法，即用4
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6倍柱体积的缓冲液1以流速1.0
‑
1.4mL/min洗脱，然后用2
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4倍柱体积的缓冲液2以流速1.0
‑
1.4mL/min洗脱。
[0027]进一步地，步骤3使用等度洗脱法，即用5倍柱体积的缓冲液1以流速1.2mL/min洗脱，然后用3倍柱体积的缓冲液2以流速1.2mL/min洗脱。
[0028]进一步地，所述融合蛋白包括第一重链、第二重链、第一轻链和第二轻链，所述第一重链的一部分和第一轻链的一部分、所述第二重链的一部分和第二轻链的一部分分别配对，且二者之一或全部形成PD
‑
1抗原结合位点，所述第一重链还包含细胞因子IL
‑
15片段以及免疫球蛋白Fc部分，所述第二重链还包含IL
‑
15受体片段以及免疫球蛋白Fc部分，所述第一重链中的细胞因子IL
‑
15本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纯化融合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，处理层析填料，上样；步骤2，使用平衡缓冲液淋洗；步骤3，使用洗脱缓冲液洗脱产品，并收集产品；所述融合蛋白包括第一重链、第二重链、第一轻链和第二轻链，所述第一重链的一部分和第一轻链的一部分、所述第二重链的一部分和第二轻链的一部分分别配对，且二者之一或全部形成PD
‑
1抗原结合位点，所述第一重链还包含细胞因子IL
‑
15片段以及免疫球蛋白Fc部分，所述第二重链还包含IL
‑
15受体片段以及免疫球蛋白Fc部分，所述第一重链中的细胞因子IL
‑
15片段与第二重链中的IL
‑
15受体片段相互结合。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脱缓冲液包含NaAc
‑
HAc、Tris
‑
盐酸、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液中的一种或几种。3.根据权利要求2所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴崇兵，顾海涛，姜晓玲，
申请(专利权)人：盛禾中国生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：