一种重组人促卵泡生成素Fc融合蛋白及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种重组人促卵泡生成素Fc融合蛋白及制备方法。本发明专利技术提供了SEQID No.5所示信号肽或其相关生物材料在如下任一中的应用：A1)制备FSH蛋白或其融合蛋白；A2)提高FSH蛋白或其融合蛋白的表达量或产量；A3)促进FSH蛋白或其融合蛋白分泌到宿主细胞外；本发明专利技术采用FSH

【技术实现步骤摘要】
一种重组人促卵泡生成素Fc融合蛋白及制备方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种重组人促卵泡生成素Fc融合蛋白及制备方法。

技术介绍

[0002]促卵泡生成素(FSH)由脑垂体分泌，成分为糖蛋白，分子量约为42kDa，由α链和β链通过非共价结合，因早期发现其对女性卵泡成熟的促进作用而得名。后来研究发现FSH在男女两性体内都是很重要的激素之一，调控发育、生长、青春期性成熟以及生殖相关的一系列生理过程。FSH在女性中的功能是促进卵泡发育和成熟，及协同促黄体生成素(LH)促使发育成熟的卵泡分泌雌激素和排卵，参与正常月经的形成；在男性中的功能是促进睾丸曲细精管的成熟和精子的生成。因此，FSH可以单独使用或与LH联合应用治疗不育不孕症。
[0003]FSH可以从脑垂体或尿液中分离提取或采用基因重组技术制备。重组FSH制品纯度高，安全性好、质量可控、与提取产品相比活性相当，备受市场青睐。临床上，FSH需连续8
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10天皮下注射给药刺激女性卵泡发育，给患者带来诸多不便和痛苦。因此，开发长效重组FSH类产品是未来的一个趋势。

技术实现思路

[0004]本专利技术一个目的是提供FSH融合蛋白。
[0005]本专利技术提供的FSH融合蛋白，为如下B1)或B2)：
[0006]B1)所述FSH融合蛋白，其A链为FSH的α链，B链为连接标签的FSH的β链；
[0007]B2)所述FSH融合蛋白，其A链为连接SP1信号肽的FSH的α链，B链为连接SP1信号肽和标签的FSH的β链；
[0008]所述SP1信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
[0009]上述标签可以为Fc、HSA、CTP或XTEN中任一或者任2种组合，优选标签为Fc标签。
[0010]优选地，B1)所示的FSH融合蛋白为FSH
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Fc融合蛋白，FSH为人FSH，具体的讲，将Fc标签融合于人FSH分子的β链的碳末端，形成FSH
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Fc的B链，B链通过Fc结构的二硫键形成同二聚体；FSH分子的α链(即FSH
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Fc的A链)通过非共价键与B链结合，形成二价FSH分子。
[0011]优选地，B2)所示的FSH融合蛋白为SP1
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FSH
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Fc融合蛋白，FSH为人FSH，具体的讲，将Fc标签融合于人FSH分子的β链的碳末端，且将SP1信号肽连接在人FSH分子的β链的氮末端，形成SP1
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FSH
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Fc的B链，B链通过Fc结构的二硫键形成同二聚体；将SP1信号肽连接在人FSH分子的α链的氮末端，形成SP1
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FSH
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Fc的A链，SP1
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FSH
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Fc的A链通过非共价键与B链结合，形成二价FSH分子。
[0012]进一步优选地，上述的FSH
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Fc融合蛋白，上述Fc来自于IgG1
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Fc，上述FSH为人FSH。Fc为IgG1
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Fc，具体的讲，采用人IgG1
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Fc的CH2和CH3区；且去除碳末端的Lys(K)氨基酸，减少分子的电荷异质性。
[0013]上述FSH融合蛋白由FSH的α链和连接Fc标签的FSH的β链非共价结合而成；
[0014]上述FSH融合蛋白由连接SP1信号肽的FSH的α链和连接SP1信号肽和Fc标签的FSH的β链非共价结合而成。
[0015]所述Fc标签在FSH的α链的C端；
[0016]所述SP1信号肽连接在FSH的α链或β链的N端。
[0017]上述FSH融合蛋白中，B1)中，所述FSH融合蛋白的A链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述FSH融合蛋白的B链的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0018]或，B2)中，所述FSH融合蛋白的A链的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；所述FSH融合蛋白的B链的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
[0019]与上述融合蛋白相关的生物材料也是本专利技术保护的范围。
[0020]上述生物材料为上述融合蛋白的编码基因或含有所述编码基因的表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞系。
[0021]上述融合蛋白的编码基因为如下C1
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C4中任一种：
[0022]C1：B1)中，所述FSH融合蛋白的A链的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述FSH融合蛋白的的B链的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
[0023]C2：B2)中，所述FSH融合蛋白的A链编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，中，所述FSH融合蛋白的的B链编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；
[0024]C3：在严格条件下与C1或C2中任一限定的DNA分子杂交且编码上述融合蛋白的DNA分子；
[0025]C4：与C1或C2中任一限定的DNA分子限定的DNA序列具有75％以上同一性且编码上述融合蛋白的DNA分子。
[0026]上述核酸分子或编码基因中，同一性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)，检索一对核苷酸序列的同一性，进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
[0027]上述核酸分子或编码基因中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
[0028]在本专利技术的具体实施方式中，所述重组表达质粒pCGS3
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SP1
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FSH
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Fc为将SEQ ID No.9所示DNA片段插入到pCGS3载体的多克隆位点(如HindIII和XhoI)，且将SEQ ID No.10所示DNA片段插入到pCGS3载体的多克隆位点(如BstBI和PacI)后得到的重组表达质粒。
[0029]其中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达前文第一方面中所述融合蛋白的DNA，该DNA不仅包括启动目的基因转录的启动子，还可包括终止目的基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
[0030]其中，所述宿主细胞为真核宿主细胞。
[0031]进一步地，所述真核宿主细胞可为HEK293细胞，CHO细胞，酵母细胞和昆虫细胞等，在本专利技术的具体实施方式中，所述宿主细胞具体为Expi293F细胞。
[0032]上述生物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.FSH融合蛋白，为如下B1)或B2)：B1)所述FSH融合蛋白，其A链为FSH的α链，B链为连接标签的FSH的β链；B2)所述FSH融合蛋白，其A链为连接SP1信号肽的FSH的α链，B链为连接SP1信号肽和标签的FSH的β链；所述SP1信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。2.根据权利要求1所述的FSH融合蛋白，其特征在于：所述标签为Fc标签。3.根据权利要求1或2所述的FSH融合蛋白，其特征在于：B1)中，所述FSH融合蛋白的A链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述FSH融合蛋白的B链的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；或，B2)中，所述FSH融合蛋白的A链的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；所述FSH融合蛋白的B链的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。4.与权利要求1
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3中任一所述融合蛋白相关的生物材料，所述生物材料为权利要求1
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3中任一所述融合蛋白的编码基因或含有所述编码基因的表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞系。5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于：所述编码基因为如下C1
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C4中任一种：C1：B1)所述FSH融合蛋白的A链的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述FSH融合蛋白的B链的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；C2：B2)所述FSH融合蛋白的A链的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述FSH融合蛋白的B链的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；C3：在严格条件下与C1或C2中任一限定的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张静静，安文琪，邢体坤，宋路萍，王斌，
申请(专利权)人：华兰基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：