一种重组人绒毛膜促性腺激素Fc融合蛋白制备方法技术

本发明专利技术公开了一种重组人绒毛膜促性腺激素Fc融合蛋白制备方法。本发明专利技术提供了SEQ ID No.5所示信号肽或其相关生物材料在如下任一中的应用：A1)制备HCG蛋白或其融合蛋白；A2)提高HCG蛋白或其融合蛋白的表达量或产量；A3)促进HCG蛋白或其融合蛋白分泌到宿主细胞外；本发明专利技术采用HCG

【技术实现步骤摘要】
一种重组人绒毛膜促性腺激素Fc融合蛋白制备方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种重组人绒毛膜促性腺激素Fc融合蛋白制备方法。

技术介绍

[0002]人绒毛膜促性腺激素(HCG)是由合体滋养细胞合成的一种糖蛋白激素，由α，β两个不同亚基组成，α亚基与垂体分泌的卵泡刺激素(HCG)、黄体生成素(LH)和促甲状腺激素(TSH)等基本相似，故相互间能发生交叉反应，而β亚基的结构各不相同。
[0003]HCG具有如下功能：1)HCG和LH的功能，维持月经黄体的寿命，使月经黄体增大成为妊娠黄体；2)促进雄激素芳香化转化为雌激素，同时刺激孕酮形成；3)抑制植物凝集素对淋巴细胞的刺激作用，人绒毛膜促性腺激素可吸附于滋养细胞表面，以免胚胎滋养层细胞被母体淋巴细胞攻击；4)类LH功能，在胎儿垂体分泌LH以前，刺激胎儿睾丸分泌睾酮促进男性性分化；5)还可促进性腺发育，对男性能刺激睾丸中间质细胞的活力，增加雄性激素(睾酮)的分泌。临床上，HCG产品适用于不孕症、黄体功能不足、功能性子宫出血、先兆流产或习惯性流产等。

技术实现思路

[0004]本专利技术一个目的是提供SP1信号肽或与其相关的生物材料的用途。
[0005]本专利技术提供了SP1信号肽或与其相关的生物材料在如下A1)
‑
A3)中任一种中的应用：
[0006]A1)制备HCG蛋白或其融合蛋白；
[0007]A2)提高HCG蛋白或其融合蛋白的表达量或产量；
[0008]A3)促进HCG蛋白或其融合蛋白分泌到宿主细胞外；
[0009]所述SP1信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
[0010]上述HCG融合蛋白，其A链为HCG的α链，其B链为连接标签的HCG的β链。上述标签可以为Fc、HSA、CTP或XTEN中任一或者任2种组合，优选标签为Fc标签。
[0011]上述连接Fc标签的HCG的β链为在HCG的β链的C端连接标签。
[0012]上述应用中，所述与SP1信号肽相关的生物材料为所述SP1信号肽的编码基因或含有所述编码基因的表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞系。
[0013]上述应用中，所述HCG融合蛋白中的A链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
[0014]所述HCG融合蛋白中的B链的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0015]本专利技术另一个目的是提供HCG融合蛋白。
[0016]本专利技术提供的HCG融合蛋白，为如下B1)或B2):
[0017]B1)所述HCG融合蛋白，其A链为HCG的α链，B链为连接标签的HCG的β链；
[0018]B2)所述HCG融合蛋白，其A链为连接SP1信号肽的HCG的α链，B链为连接SP1信号肽和标签的HCG的β链；
ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)，检索一对核苷酸序列的同一性，进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
[0039]上述核酸分子或编码基因中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
[0040]在本专利技术的具体实施方式中，所述重组表达质粒pCGS3
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SP1
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HCG
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Fc为将SEQ ID No.9所示DNA片段插入到pCGS3载体的多克隆位点(如HindIII和XhoI)，且将SEQ ID No.10所示DNA片段插入到pCGS3载体的多克隆位点(如BstBI和PacI)后得到的重组表达质粒。
[0041]其中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达前文第一方面中所述融合蛋白的DNA，该DNA不仅包括启动目的基因转录的启动子，还可包括终止目的基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
[0042]其中，所述宿主细胞为真核宿主细胞。
[0043]进一步地，所述真核宿主细胞可为HEK293细胞，CHO细胞，酵母细胞和昆虫细胞等，在本专利技术的具体实施方式中，所述宿主细胞具体为Expi293F细胞。
[0044]上述生物材料在如下A1)
‑
A3)中任一种中的应用也是本专利技术保护的范围：
[0045]A1)制备HCG蛋白或其融合蛋白；
[0046]A2)提高HCG蛋白或其融合蛋白的表达量或产量；
[0047]A3)促进HCG蛋白或其融合蛋白分泌到宿主细胞外。
[0048]本专利技术还有一个目的是提供一种制备HCG蛋白的方法。
[0049]本专利技术提供的方法，包括如下步骤：使上述融合蛋白的编码基因在宿主菌或宿主细胞中进行表达，得到HCG蛋白。
[0050]上述方法包括如下步骤：
[0051]1)将上述融合蛋白中的A链和B链的编码基因导入宿主菌，得到重组菌；
[0052]2)培养所述重组菌，得到HCG蛋白。
[0053]上述融合蛋白中的A链和B链的编码基因通过重组质粒pCGS3
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SP1
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HCG
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Fc导入宿主菌；
[0054]在本专利技术的具体实施方式中，所述宿主细胞具体为Expi293F细胞。
[0055]上述步骤2)中，所述培养为培养至细胞活率降至65％～75％时终止培养。
[0056]在步骤2)后，还包括步骤3)：从培养后的培养产物的上清中获得HCG
‑
Fc融合蛋白：收集培养物于3500g离心30min，收集上清进行超滤浓缩、Protein A 4FF填料亲和层析和超滤置换。
[0057]本专利技术设计一种HCG
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Fc融合蛋白，用于长效HCG的候选分子，并在此基础上进行信号肽优化实验。研究发现人工改造信号肽SP1(SEQ ID No.5)引导HCG
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Fc融合蛋白真核细胞分泌表达。但是信号肽SP1并非对所有蛋白都可以提高分泌表达(本实验室积累的不同蛋白表达经验表明，如SP1信号肽引导的CD19蛋白表达极低)，这一点在进行本专利技术实验的同时也做了相关实验。因此，人工改造信号肽SP1对于引导HCG
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Fc融合蛋白真核细胞分泌表达量显著优于抗体轻链信号肽SP2和荧光素酶信号肽SP3，更适用于大规模工业化生产，降低生产成本。
附图说明
[0058]图1为人工改造信号肽SP1分泌表达预测图。SP(Sec/SPI)为预测为信号肽概率，CS为预测信号肽酶酶切位点，OTHERS代表非信号肽的概率。纵坐标为氨基酸序列为预测结构的概率，横坐标为蛋白质氨基酸序列。其中，A为HCG
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Fc融合蛋白A链预测图，其中，B为HCG
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Fc融合蛋白B链预测图。
[0059]图2为HCG
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Fc融合蛋白重组表达质粒构建酶切鉴定图。其中A链采用HindIII和XhoI酶切，B链采用BstBI和PacI酶切，1为pCGS3
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.SP1信号肽或与其相关的生物材料在如下A1)
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A3)中任一种中的应用：A1)制备HCG蛋白或其融合蛋白；A2)提高HCG蛋白或其融合蛋白的表达量或产量；A3)促进HCG蛋白或其融合蛋白分泌到宿主细胞外；所述SP1信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述HCG融合蛋白，其A链为HCG的α链，其B链为连接标签的HCG的β链。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述与SP1信号肽相关的生物材料为所述SP1信号肽的编码基因或含有所述编码基因的表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞系。4.HCG融合蛋白，为如下B1)或B2):B1)所述HCG融合蛋白，其A链为HCG的α链，B链为连接标签的HCG的β链；B2)所述HCG融合蛋白，其A链为连接SP1信号肽的HCG的α链，B链为连接SP1信号肽和标签的HCG的β链；所述SP1信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。5.根据权利要求4所述的HCG融合蛋白，其特征在于：B1)中，所述HCG融合蛋白的A链的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述HCG融合蛋白的B链的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；或，B2)中，所述HCG融合蛋白的A链的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；所述HCG融合蛋白的B链的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。6.与权利要求4或5所述融合蛋白相关的生物材料，所述生物材料为权利要求4或5所述融合蛋白的编码基...

【专利技术属性】
技术研发人员：张静静，安文琪，邢体坤，宋路萍，王斌，
申请(专利权)人：华兰基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：