TRIM24和EGFR双特异性结合肽制造技术

本发明专利技术公开了TRIM24结合肽、TRIM24和EGFR双特异性结合肽以及含有其的药物。TRIM24结合肽的序列为：VLFX1X2YYTX3X4TM；TRIM24和EGFR双特异性结合肽的序列为VLFWTYYTPSTM。本发明专利技术通过D12噬菌体文库筛选到6个特异性结合TRIM24蛋白的结合肽，其中一个结合肽与EGFR蛋白也有很强的结合特异性，为双蛋白结合肽，为治疗细胞胶质瘤疾病奠定了基础。胞胶质瘤疾病奠定了基础。胞胶质瘤疾病奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
TRIM24和EGFR双特异性结合肽


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及TRIM24结合肽、TRIM24和EGFR双特异性结合肽以及含有其的药物。

技术介绍

[0002]脑胶质瘤是一种常见的中枢神经系统恶性肿瘤，其中多形性胶质母细胞瘤(GBM)是恶性度最高的原发性脑肿瘤。恶性脑胶质瘤中存在一部分具有自我更新能力、多向分化能力和极强致瘤能力的细胞，即脑胶质瘤干细胞(GSCs)，GSCs被认为是恶性脑胶质瘤复发和复发后预后较差的主要原因。GSCs在体外已被证明具有自我更新能力，可分化为多种细胞谱系，形成神经球，并表达特异性的神经干细胞标志物。对于诊断为GBM的患者，目前常规的治疗方法是手术切除肿瘤，术后放射治疗并辅以替莫唑胺。手术可以减轻症状，减轻肿瘤的负担，并为诊断和分子水平分析提供充分的组织支持。
[0003]TRIM24蛋白具有TRIM家族特征的氨基末端RBCC结构域(Ring，B
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Box和Coiled
‑
Coil)，以及定义TIF1亚家族的PHD
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bromo结构域。TRIM24已被证明可以作为致癌基因或肿瘤抑制因子。虽然小鼠TRIM24的基因缺失促进肝细胞癌，但是人类TRIM24的异常过度表达与多种癌症，患者的癌症进展和患者生存率呈正相关。TRIM24在胶质瘤中是高表达的，并且随着级别增高表达明显增加。
[0004]EGFR为识别调控细胞增殖和生长的表皮生长因子，进行信号传导的受体，其在细胞增殖、分化、移动等细胞功能中具有重要的作用。EGFR的信号传导促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，增加肿瘤细胞的运动性和血管新生。EGFR的表达和强烈表达报道在各种肿瘤类型中，已知在三分之一的上皮癌中EGFR表达水平高，EGFR的强烈表达常常与预后不良相关。此外，由于已知EGFR与癌症的发生和发展有关，因此已经进行了以EGFR为靶标的化疗药物的开发。EGFR亦在多形性胶质母细胞瘤中高表达。
[0005]抑制TRIM24蛋白和EGFR蛋白在体内的表达水平可以缓解胶质瘤或者治疗胶质瘤疾病，因此，开发与TRIM24和EGFR特异性结合的结合肽，可以为靶向治疗胶质瘤提供技术基础支持。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供TRIM24结合肽、TRIM24和EGFR双特异性结合肽以及含有其的药物。
[0007]一种TRIM24结合肽，其为具有如下氨基酸序列的短肽：VLFX1X2YYTX3X4TM；
[0008]其中，X1为Y、W或C；X2为L、Y或T；X3为G、P、A或W；X4为S或T。
[0009]一种TRIM24和EGFR双特异性结合肽，其为具有如下氨基酸序列的短肽：VLFWTYYTPSTM。
[0010]所述结合肽的标记体。
[0011]所述标记体为放射性同位素、生物素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、FITC、罗丹明
NaCl)溶液，搅拌，在4℃孵育18h。
[0034](8)在高速离心机中，4℃、9000
×
g下离心10min，除去上清液，向沉淀的噬菌体中加入TBS溶液1mL，混悬，移至微离心管中在4℃、15000
×
g下离心5min，将上清液回收至另外的离心管，加入200uLPEG/NaCl，使用混合器搅拌，冰上孵育1h，使菌体沉淀。
[0035](9)在4℃、15000
×
g下离心10min，沉淀噬菌体，除去上清液，向得到的噬菌体沉淀中添加200uL 0.02％NaN3/TBS，混悬，在4℃、15000
×
g下离心5min，回收上清液，测定噬菌体浓缩液的效价。
[0036](10)使用浓缩的噬菌体溶液，进行第2
‑
3次筛选。
[0037]效价测定：3mL LB中培养ER2738菌至对数增值期，向菌体培养液中添加噬菌体溶液，使用混合器搅拌，在室温下孵育5min，使其与4mL溶解的顶层琼脂溶液混合，铺在LB/IPTG/X gal板上，在37℃孵育16h，计数得到的蓝色菌斑的数量。使用噬菌体稀释倍数计算得出的噬菌体数(计数的菌斑数
×
稀释倍数/10uL)。
[0038]图1显示了使用噬菌体文库的实验输出效价(从洗涤后的靶分子洗脱的噬菌体效价)与输入效价(靶标分子中加入的噬菌体效价)比值变化，显示第3轮有大幅度增加，预示着选择了展示TRIM24/Fc特异性结合的噬菌体。
[0039]实施例2
[0040]测序分析：
[0041]根据常规方法克隆D12文库的筛选实验的第3轮得到的噬菌体，确定噬菌体展示肽的碱基序列，从而确定展示肽序列。
[0042]结果见表1：
[0043]表1
[0044]噬菌体序列号展示肽序列1
‑
101VLFYLYYTGTTM1
‑
102VLFYLYYTPSTM1
‑
103VLFWTYYTPSTM1
‑
104VLFWTYYTPSTM1
‑
105VLFCTYYTATTM1
‑
106VLFCYYYTWTTM
[0045]实施例3
[0046]将作为靶标蛋白的TRIM24/Fc与作为被TRIM24/Fc识别的Fc部位的IgG1Fc、作为标准蛋白的BSA以1μg/孔添加到96孔微板中，通过于4℃放置12h固定。除去蛋白溶液，添加300μl封闭缓冲液，通过在37℃孵育1h封闭孔。除去封闭缓冲液后，用200μl洗涤液0.5％TBST洗涤孔3次，最后添加100μl 0.5％TBST。向上述孔中添加扩增的噬菌体溶液(1
‑
101、1
‑
102、1
‑
103、1
‑
104、1
‑
105、1
‑
106噬菌体、以及M13KE(非肽展示噬菌体))，使其为1
×
10
10
PFU，通过加样器吹打混合。将反应在室温下平稳振荡1。除去反应液，用0.5％TBST 200μl洗涤孔10次后，向孔中添加100μl0.2M甘氨酸
‑
HCl(pH 2.2)，用加样器吹打搅拌后，室温下振荡10min。从孔中将洗脱液回收至微离心管，通过添加15μl 1MTris
‑
HCl(pH9.1)中和，得到结合靶标的噬菌体溶液。通过效价测定进行回收的噬菌体结合能力判断。
[0047]结果如图2
‑
3所示，1
‑
101、1
‑
102、1
‑
103、1
‑
104、1
‑
105、1
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106噬菌体对TRIM24/Fc
的结合性，显著高于作为Fc部分的IgG1Fc及作为标准蛋白的BSA。对于M13KE噬菌体，没有发现与固定本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种TRIM24结合肽，其特征在于，其为具有如下氨基酸序列的短肽：VLFX1X2YYTX3X4TM；其中，X1为Y、W或C；X2为L、Y或T；X3为G、P、A或W；X4为S或T。2.一种TRIM24和EGFR双特异性结合肽，其特征在于，其为具有如下氨基酸序列的短肽：VLFWTYYTPSTM。3.权利要求1所述结合肽的标记体。4.根据权利要求3所述结合肽的标记体，其特征在于，所述标记体为放射性同位素、生物素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、FITC、罗丹明或正电子核素。5.权利要求1
...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆军，柴燕群，
申请(专利权)人：上海阔然开朗医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：