一种重组马绒毛膜促性腺激素融合蛋白及其制备方法和其应用技术

本发明专利技术提供了一种重组马绒毛膜促性腺激素融合蛋白及其制备方法和其应用。本发明专利技术所述重组马绒毛膜促性腺激素融合蛋白具体包括reCG‑Fc融合蛋白，所述reCG‑Fc融合蛋白包含α和β‑Fc亚基，所述β‑Fc亚基由eCGβ亚基与免疫球蛋白Fc片段融合而成，α亚基与β‑Fc亚基通过范德华力连接。本发明专利技术通过利用哺乳动物真核表达系统表达该reCG‑Fc融合蛋白。将本发明专利技术制备的reCG‑Fc融合蛋白用于动物繁殖领域，包括母畜的同期发情和超数排卵，比目前从怀孕母马血清中提取的孕马血清(PMSG)，质量更稳定、纯度更高、杂质更少，药效更好，可替代PMSG在动物繁殖中的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种重组马绒毛膜促性腺激素融合蛋白及其制备方法和其应用
本专利技术属于生物医药和动物繁殖
，具体涉及一种重组马绒毛膜促性腺激素融合蛋白及其制备方法和其应用。
技术介绍
马绒毛膜促性腺激素(EquineChorionieGonadotropin，eCG)是妊娠马、驴或斑马的子宫内膜杯组织分泌的一种糖蛋白类激素，主要存在于孕马血清中，因此又称为孕马血清促性腺激素(PregnantMareSerumGonadotropin，PMSG)。eCG含有α和β两个亚基，α亚基由96个氨基酸残基组成，含有2个N-糖基化位点，分别位于N56和N82位。β亚基由149个氨基酸残基组成，含有1个N-糖基化位点和12个0-糖基化位点，其中N-糖基化位点位于N33位，0-糖基化位点分别为于N118、N123、N127、N128、N129、N130、N131、N133、N137、N140、N141和N149位，α亚基和β亚基均通过N-糖苷键连接于氨基酸残基的氨基上。eCG具有促卵泡素(FollicleStimulatingHormone，FSH)和促黄体素(LuteinizingHormone，LH)的双重作用，但以FSH的作用为主。对于雌性动物，eCG作用于卵巢，可以促进卵泡发育、成熟、排卵以及黄体生成；对于雄性动物，eCG作用于睾丸，可以促进曲细精管的发育、精子的生成和睾丸间质细胞雄激素的分泌。因此，在动物繁殖领域，eCG可用于同期发情、超数排卵、胚胎移植以及母畜卵巢疾病的治疗。eCG唾液酸含量高，占分子总重的45％左右，在动物体内肾小球的清除率低，作用时间长。半衰期长，在牛体内，注射eCG120h后血液中仍有有效浓度，因此一个发情周期只需要注射一针。而类似的生殖激素药物，如猪垂体促卵泡素(pFSH)，半衰期短一个发情周期需要每日一次或每日两次注射，连续注射3-5天。因此eCG作用的持续性使其在动物繁殖领域广泛应用。目前市售的PMSG产品是从妊娠40-120天的母马血清中提取的，一般使用偏磷酸去除血清中杂蛋白，之后用乙醇分段沉淀，这种处理方法得到的eCG生产效价低，精品PMSG的效价约1000IU/mg，所以PMSG在畜牧生产上受到很大限制，而市场急需大量的PMSG产品。同时不同批号PMSG的FSH/LH比率差异大，导致PMSG作用差异大。从怀孕母马采集血清制备PMSG，采血过多经常会导致母马流产、胎马死亡，方式野蛮且不人道。
技术实现思路
基于上述问题，本专利技术提供了一种重组马绒毛膜促性腺激素融合蛋白及其制备方法。本专利技术的一个目的是提供一种重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列包括下述1)-3):1)Fc片段的氨基酸序列；和/或将Fc片段的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，且具有与Fc片段相同功能的由Fc片段的氨基酸序列衍生的氨基酸序列；2)马绒毛膜促性腺激素eCG的α亚基的氨基酸序列；和/或将所述α亚基的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，且具有与所述α亚基相同功能的由所述α亚基的氨基酸序列衍生的氨基酸序列；3)马绒毛膜促性腺激素eCG的β亚基的氨基酸序列；和/或将所述β亚基的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，且具有与所述β亚基相同功能的由所述β亚基的氨基酸序列衍生的氨基酸序列；和/或所述重组蛋白包括，蛋白的折叠或修饰包括下述1)-4)所述中的至少一种：1)与任一马绒毛膜促性腺激素eCG的α亚基的折叠和/或修饰一致；2)与任一马绒毛膜促性腺激素eCG的β亚基的折叠和/或修饰一致；3)由任一真核表达系统完成的折叠和/或修饰；具体的，所述折叠和/或修饰不同于上述1)和2)所述的折叠和/或修饰；4)经人工折叠和/或修饰；具体的，所述折叠和/或修饰不同于上述1)、2)和3)所述的折叠和/或修饰。具体的，所述蛋白还包括下述1)-6)中所述的至少一种：1)所述β亚基与Fc片段连接构成β-Fc亚基，所述α亚基与β-Fc亚基通过非共价键结合；2)所述α亚基与Fc片段连接构成α-Fc亚基，所述β亚基与α-Fc亚基通过非共价键结合；3)所述Fc片段包含免疫球蛋白铰链区、CH2和CH3区；4)所述Fc片段来自哺乳动物的免疫球蛋白；5)当所述蛋白的折叠和/或修饰包括由任一真核表达系统完成的折叠和/或修饰时，所述真核表达系统包括CHO、HEK293、BHK、NS0和/或Sp2/0细胞中的至少一种；6)当所述蛋白的折叠和/或修饰包括经人工折叠和/或修饰时，所述修饰包括糖基化、聚乙二醇化、乙酰化和/或与BSA结合中的至少一种。具体的，所述蛋白还包括下述1)-7)中所述的至少一种：1)当所述蛋白包括所述β亚基与Fc片段连接构成β-Fc亚基和/或所述α亚基与Fc片段连接构成α-Fc亚基时，所述连接包括β和/或α亚基与Fc片段之间通过肽键直接连接；2)当所述蛋白包括所述β亚基与Fc片段连接构成β-Fc亚基和/或所述α亚基与Fc片段连接构成α-Fc亚基时，所述连接包括β和/或α亚基与Fc片段之间通过连接体linker连接；3)所述Fc片段来自人、猪、牛、羊、马、和/或狗的免疫球蛋白；4)当所述蛋白包括β-Fc亚基时，所述β-Fc亚基的氨基酸序列为序列表中SEQIDNO:5所示的氨基酸序列；5)当所述蛋白包括β-Fc亚基时，所述β-Fc亚基包括将序列表中SEQIDNO:5所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，且具有与序列表中SEQIDNO:5所示的氨基酸序列同等功能的由具有序列表中SEQIDNO:5所示氨基酸序列的亚基衍生的蛋白；6)当所述蛋白包括β-Fc亚基时，所述β-Fc亚基包括与序列表中SEQIDNO:5所示氨基酸序列同源性在90％以上的，且具有与序列表中SEQIDNO:5所示的氨基酸序列同等功能的蛋白；7)当所述蛋白的折叠和修饰包括由任一真核表达系统完成的折叠和/或修饰时，所述真核表达系统为CHO。具体的，所述蛋白还包括下述1)-7)中所述的至少一种：1)所述α亚基的氨基酸序列为序列表中SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；2)所述α亚基包括将序列表中SEQIDNO:1所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，且具有与马绒毛膜促性腺激素eCG的α亚基同等功能的由具有序列表中SEQIDNO:1所示氨基酸序列的α亚基衍生的蛋白；3)所述α亚基包括与序列表中SEQIDNO:1所示氨基酸序列同源性在90％以上的，且具有与马绒毛膜促性腺激素eCG的α亚基同等功能的氨基酸序列构成的蛋白；4)所述β亚基的氨基酸序列为序列表中SEQIDNO:3所示的氨基酸序列；5)所述β亚基包括将序列表中SEQIDNO:3所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，且具有与马绒毛膜促性腺激素eCG的β亚基同等功能的由具有序列表中SEQIDNO:3所示氨基酸序列的β亚基衍生的蛋白；6)所述β亚基包括与序列表中SEQIDNO:3所示氨基酸序列同源性在90％以上的，且具有与马绒毛膜促性腺激素eCG的β亚基同等功能的氨基酸序列构成的蛋白；7)所述Fc片段来自人的免疫球蛋白。具体的，所述蛋白的制备方法包括，通过真核表达系统表达本专利技术任一所述蛋白。具体的，所述蛋白的制备方法还包括下述1)-4)中所述的至少一种本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列包括下述1)‑3):1)Fc片段的氨基酸序列；和/或将Fc片段的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，且具有与Fc片段相同功能的由Fc片段的氨基酸序列衍生的氨基酸序列；2)马绒毛膜促性腺激素eCG的α亚基的氨基酸序列；和/或将所述α亚基的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，且具有与所述α亚基相同功能的由所述α亚基的氨基酸序列衍生的氨基酸序列；3)马绒毛膜促性腺激素eCG的β亚基的氨基酸序列；和/或将所述β亚基的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，且具有与所述β亚基相同功能的由所述β亚基的氨基酸序列衍生的氨基酸序列；和/或所述重组蛋白包括，蛋白的折叠或修饰包括下述1)‑4)所述中的至少一种：1)与任一马绒毛膜促性腺激素eCG的α亚基的折叠和/或修饰一致；2)与任一马绒毛膜促性腺激素eCG的β亚基的折叠和/或修饰一致；3)由任一真核表达系统完成的折叠和/或修饰；具体的，所述折叠和/或修饰不同于上述1)和2)所述的折叠和/或修饰；4)经人工折叠和/或修饰；具体的，所述折叠和/或修饰不同于上述1)、2)和3)所述的折叠和/或修饰。...

【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列包括下述1)-3):1)Fc片段的氨基酸序列；和/或将Fc片段的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，且具有与Fc片段相同功能的由Fc片段的氨基酸序列衍生的氨基酸序列；2)马绒毛膜促性腺激素eCG的α亚基的氨基酸序列；和/或将所述α亚基的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，且具有与所述α亚基相同功能的由所述α亚基的氨基酸序列衍生的氨基酸序列；3)马绒毛膜促性腺激素eCG的β亚基的氨基酸序列；和/或将所述β亚基的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，且具有与所述β亚基相同功能的由所述β亚基的氨基酸序列衍生的氨基酸序列；和/或所述重组蛋白包括，蛋白的折叠或修饰包括下述1)-4)所述中的至少一种：1)与任一马绒毛膜促性腺激素eCG的α亚基的折叠和/或修饰一致；2)与任一马绒毛膜促性腺激素eCG的β亚基的折叠和/或修饰一致；3)由任一真核表达系统完成的折叠和/或修饰；具体的，所述折叠和/或修饰不同于上述1)和2)所述的折叠和/或修饰；4)经人工折叠和/或修饰；具体的，所述折叠和/或修饰不同于上述1)、2)和3)所述的折叠和/或修饰。2.根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白还包括下述1)-6)中所述的至少一种：1)所述β亚基与Fc片段连接构成β-Fc亚基，所述α亚基与β-Fc亚基通过非共价键结合；2)所述α亚基与Fc片段连接构成α-Fc亚基，所述β亚基与α-Fc亚基通过非共价键结合；3)所述Fc片段包含免疫球蛋白铰链区、CH2和CH3区；4)所述Fc片段来自哺乳动物的免疫球蛋白；5)当所述蛋白的折叠和/或修饰包括由任一真核表达系统完成的折叠和/或修饰时，所述真核表达系统包括CHO、HEK293、BHK、NS0和/或Sp2/0细胞中的至少一种；6)当所述蛋白的折叠和/或修饰包括经人工折叠和/或修饰时，所述修饰包括糖基化、聚乙二醇化、乙酰化和/或与BSA结合中的至少一种。3.根据权利要求2所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白还包括下述1)-7)中所述的至少一种：1)当所述蛋白包括所述β亚基与Fc片段连接构成β-Fc亚基和/或所述α亚基与Fc片段连接构成α-Fc亚基时，所述连接包括β和/或α亚基与Fc片段之间通过肽键直接连接；2)当所述蛋白包括所述β亚基与Fc片段连接构成β-Fc亚基和/或所述α亚基与Fc片段连接构成α-Fc亚基时，所述连接包括β和/或α亚基与Fc片段之间通过连接体linker连接；3)所述Fc片段来自人、猪、牛、羊、马、和/或狗的免疫球蛋白；4)当所述蛋白包括β-Fc亚基时，所述β-Fc亚基的氨基酸序列为序列表中SEQIDNO:5所示的氨基酸序列；5)当所述蛋白包括β-Fc亚基时，所述β-Fc亚基包括将序列表中SEQIDNO:5所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，且具有与序列表中SEQIDNO:5所示的氨基酸序列同等功能的由具有序列表中SEQIDNO:5所示氨基酸序列的亚基衍生的蛋白；6)当所述蛋白包括β-Fc亚基时，所述β-Fc亚基包括与序列表中SEQIDNO:5所示氨基酸序列同源性在90％以上的，且具有与序列表中SEQIDNO:5所示的氨基酸序列同等功能的蛋白；7)当所述蛋白的折叠和修饰包括由任一真核表达系统完成的折叠和/或修饰时，所述真核表达系统为CHO。4.根据权利要求1、2和/或3所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白还包括下述1)-7)中所述的至少一种：1)所述α亚基的氨基酸序列为序列表中SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；2)所述α亚基包括将序列表中SEQIDNO:1所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，且具有与马绒毛膜促性腺激素eCG的α亚基同等功能的由具有序列表中SEQIDNO:1所示氨基酸序列的α亚基衍生的蛋白；3)所述α亚基包括与序列表中SEQIDNO:1所示氨基酸序列同源性在90％以上的，且具有与马绒毛膜促性腺激素eCG的α亚基同等功能的氨基酸序列构成的蛋白；4)所述β亚基的氨基酸序列为序列表中SEQIDNO:3所示的氨基酸序列；5)所述β亚基包括将序列表中SEQIDNO:3所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，且具有与马绒毛膜促性腺激素eCG的β亚基同等功能的由具有序列表中SEQIDNO:3所示氨基酸序列的β亚基衍生的蛋白；6)所述β亚基包括与序列表中SEQIDNO:3所示氨基酸序列同源性在90％以上的，且具有与马绒毛膜促性腺激素eCG的β亚基同等功能的氨基酸序列构成的蛋白；7)所述Fc片段来自人的免疫球蛋白。5.根据权利要求1、2、3和/或4所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白的制备方法包括，通过真核表达系统表达权利要求1、2、3和/或4任一所述蛋白。6.根据权利要求5所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白的制备方法还包括，下述1)-4)中所述的至少一种：1)所述真核表达系统包括CHO、HEK293、BHK、NS0和/或Sp2/0细胞中的至少一种；2)所述通过真核表达系统表达权利要求1、2、3和/或4...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗昊澍，师磊，韩国，
申请(专利权)人：北京伟杰信生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11