重组猪FSH-CTP融合蛋白及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供一种重组猪FSH‑CTP融合蛋白，所述融合蛋白是指猪FSH的β亚基直接或间接与人、灵长类或马属哺乳动物绒毛膜促性腺激素的β亚基羧端肽CTP相连，猪FSH的α亚基通过范德华力与猪FSH的β亚基结合。所述融合蛋白可基于基因工程技术，利用真核表达系统制备得到。本发明专利技术提供的猪FSH‑CTP融合蛋白与猪垂体FSH相比，半衰期更长，药效更好，可代替目前市场上的猪垂体FSH和孕马血清促性腺激素在动物繁殖领域使用。

* recombinant pig FSH-CTP fusion protein and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
重组猪FSH-CTP融合蛋白及其制备方法与应用
本专利技术涉及生物医药和动物繁殖
，具体地说，涉及重组猪FSH-CTP融合蛋白及其制备方法与应用。
技术介绍
猪促卵泡素(PorcineFollicle-stimulatinghormone，简称pFSH)是猪垂体前叶分泌的一种糖蛋白类促性腺激素，pFSH可以促进母猪子宫内膜、卵巢和卵泡的生长；促进雌激素的合成与分泌；诱导公猪曲细精管的发育和维持精子生成。pFSH在动物繁殖领域中常用于同期发情、超数排卵、胚胎移植、母畜卵巢疾病的治疗。pFSH含有α和β两个亚基，α亚基负责信号转录，β亚基参与受体结合发挥生物功能。pFSH的α亚基与垂体的其他糖蛋白激素，如猪促黄体素(pLH)、猪促甲状腺素(pTSH)的α亚基完全相同，由96个氨基酸残基组成，含有2个N-连接糖基化位点，位于N56和N82。而pFSH、pLH和pTSH的β亚基不同，pFSHβ亚基含有109个氨基酸残基，亦含有2个N-连接糖基化位点，位于N5和N22。目前动物繁殖领域常见的促性腺类激素主要包括猪垂体FSH(pFSH)和孕马血清促性腺激素(PMSG)。pFSH主要从猪脑垂体中提取纯化，如Folltropin-V(加拿大贝尔尼奇公司)，纯度不高，含量少，价格昂贵，且因LH的存在，副作用大。此外半衰期短(大鼠体内半衰期约为5h)，用于家畜同期发情和超数排卵，需要连续注射3-5天，增加了用户的药物投入成本和劳动力，所以在实际应用中受到限制。PMSG是一种马属动物胎盘尿囊绒毛膜细胞分泌的糖蛋白激素，兼具FSH(高)和LH(低)活性，半衰期长(在牛中可达120h以上)，药效持久，仅需注射一次即可获得理想效果。但是PMSG主要是从怀孕母马血清中提取的，来源有限、产品批次差异大，采血过多会导致母马流产、胎马死亡。基于猪垂体FSH和PMSG在实际应用中的不便和限制，须开发长效FSH制剂，以延长pFSH半衰期，增加pFSH在动物体内的残留时间。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供重组猪FSH-CTP融合蛋白及其制备方法与应用。本专利技术的构思如下：通过增加FSH的糖基化程度使其分子质量和体积增加，肾小球的肾清除率降低，FSH在体内的作用时间延长。CTP包含了数个O-连接糖基化位点，能增加唾液酸糖基化侧链，提高糖蛋白的分子质量。使用哺乳动物表达体系，尤其是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达重组蛋白，能获得在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然的蛋白分子。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供的重组猪FSH-CTP融合蛋白，所述融合蛋白是指猪FSH的β亚基直接或间接与绒毛膜促性腺激素的β亚基羧端肽CTP相连，猪FSH的α亚基通过范德华力与猪FSH的β亚基结合。其中，所述绒毛膜促性腺激素来自于人、灵长类或马属哺乳动物。优选来自人和马。人CTP由28个氨基酸残基组成，含有4个O-连接糖基化位点；马CTP由35个氨基酸残基组成，含有12个O-连接糖基化位点。所述融合蛋白为pFSH-hCTP或pFSH-eCTP。pFSH-hCTP：含有两条肽链，符合以下方程：(pFSHα:pFSHβ-hCTP)2，其中pFSHα是指猪FSH的α亚基；冒号代表猪FSHα亚基和β亚基以范德华力连接；pFSHβ是指猪FSH的β亚基；hCTP是指人绒毛膜促性腺激素β亚基羧端肽；括号外下标2代表所述猪FSH融合蛋白为二价同二聚体。优选地，所述融合蛋白pFSH-hCTP中的pFSHβ-hCTP为：i)由SEQIDNO:3所示的氨基酸序列构成的蛋白；或ii)SEQIDNO:3所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等功能的由i)衍生的蛋白；或iii)与SEQIDNO:3所示氨基酸序列同源性在90％以上的，且具有同等功能的氨基酸序列构成的蛋白。pFSH-eCTP：含有两条肽链，符合以下方程：(pFSHα:pFSHβ-eCTP)2，其中pFSHα是指猪FSH的α亚基；冒号代表猪FSHα亚基和β亚基以范德华力连接；pFSHβ是指猪FSH的β亚基；eCTP是指马绒毛膜促性腺激素β亚基羧端肽；括号外下标2代表所述猪FSH融合蛋白为二价同二聚体。优选地，所述融合蛋白pFSH-eCTP中的pFSHβ-eCTP为：iv)由SEQIDNO:5所示的氨基酸序列构成的蛋白；或v)SEQIDNO:5所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等功能的由iv)衍生的蛋白；或vi)与SEQIDNO:5所示氨基酸序列同源性在90％以上的，且具有同等功能的氨基酸序列构成的蛋白。所述pFSHα的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，或者与SEQIDNO:1同源性在90％以上的，且具有同等功能的氨基酸序列构成的蛋白。经过修饰的蛋白，包括两种融合蛋白pFSH-hCTP、pFSH-eCTP或猪FSH经过糖基化、聚乙二醇化、乙酰化或与BSA结合等，均属于本专利技术的保护范围。经过改造的蛋白，包括两种融合蛋白pFSH-hCTP、pFSH-eCTP或猪FSH蛋白与CTP或与其他蛋白融合构成的不改变猪FSH蛋白活性的融合蛋白，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供表达盒、表达载体、克隆载体、工程菌或转基因细胞系，其包含编码上述猪FSH-CTP融合蛋白的核酸。本专利技术的长效重组猪FSH-CTP融合蛋白可按如下方法制备得到：所述融合蛋白pFSH-hCTP的制备如下：优化并人工合成pFSHα和pFSHβ-hCTP的编码基因，优化后的pFSHα和pFSHβ-hCTP基因序列分别构建于不同的表达盒，然后连接到同一表达载体上，转化宿主细胞，并在宿主细胞中表达，分离纯化目标蛋白；或者，将优化后的pFSHα和pFSHβ-hCTP基因序列分别构建到表达载体上，所得重组载体共同转化宿主细胞，并在宿主细胞中表达，分离纯化目标蛋白。所述融合蛋白pFSH-eCTP的制备如下：优化并人工合成pFSHα和pFSHβ-eCTP的编码基因，优化后的pFSHα和pFSHβ-eCTP基因序列分别构建于不同的表达盒，然后连接到同一表达载体上，转化宿主细胞，并在宿主细胞中表达，分离纯化目标蛋白；或者，将优化后的pFSHα和pFSHβ-eCTP基因序列分别构建到表达载体上，所得重组载体共同转化宿主细胞，并在宿主细胞中表达，分离纯化目标蛋白。其中，优化后的pFSHα、pFSHβ-hCTP和pFSHβ-eCTP的基因序列分别如SEQIDNO:2、4和6所示。本专利技术所述表达载体为真核表达载体，包括但不限于pcDNA3.1，所述宿主细胞为真核细胞，包括但不限于293、CHO细胞。本专利技术还提供一种促排卵药物或组合物，其活性成分为所述重组猪FSH-CTP融合蛋白pFSH-hCTP和/或pFSH-eCTP。本专利技术还提供所述重组猪FSH-CTP融合蛋白的以下任一种应用：1)促进动物繁殖中的应用，包括同期发情、超数排卵；2)治疗动物生殖相关疾病的药物制备中的应用。其中，所述动物为哺乳动物，包括猪、牛、羊、马或狗；优选猪。本专利技术还提供上述长效重组猪FSH-CTP融合蛋白在动物繁殖领域中的应用。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：(一)本专利技术提供的重组猪FSH-CTP融合蛋白，以及它们的衍生蛋白或经过修饰的蛋白，纯化后的蛋白纯度高本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.重组猪FSH‑CTP融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是指猪FSH的β亚基直接或间接与绒毛膜促性腺激素的β亚基羧端肽CTP相连，猪FSH的α亚基通过范德华力与猪FSH的β亚基结合；其中，所述绒毛膜促性腺激素来自于人、灵长类或马属哺乳动物。

【技术特征摘要】
1.重组猪FSH-CTP融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是指猪FSH的β亚基直接或间接与绒毛膜促性腺激素的β亚基羧端肽CTP相连，猪FSH的α亚基通过范德华力与猪FSH的β亚基结合；其中，所述绒毛膜促性腺激素来自于人、灵长类或马属哺乳动物。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为pFSH-hCTP或pFSH-eCTP；pFSH-hCTP：含有两条肽链，符合以下方程：(pFSHα:pFSHβ-hCTP)2，其中pFSHα是指猪FSH的α亚基；冒号代表猪FSHα亚基和β亚基以范德华力连接；pFSHβ是指猪FSH的β亚基；hCTP是指人绒毛膜促性腺激素β亚基羧端肽；括号外下标2代表所述猪FSH融合蛋白为二价同二聚体；pFSH-eCTP：含有两条肽链，符合以下方程：(pFSHα:pFSHβ-eCTP)2，其中pFSHα是指猪FSH的α亚基；冒号代表猪FSHα亚基和β亚基以范德华力连接；pFSHβ是指猪FSH的β亚基；eCTP是指马绒毛膜促性腺激素β亚基羧端肽；括号外下标2代表所述猪FSH融合蛋白为二价同二聚体。3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白pFSH-hCTP中的pFSHβ-hCTP为：i)由SEQIDNO:3所示的氨基酸序列构成的蛋白；或ii)SEQIDNO:3所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等功能的由i)衍生的蛋白；或iii)与SEQIDNO:3所示氨基酸序列同源性在90％以上的，且具有同等功能的氨基酸序列构成的蛋白。4.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白pFSH-eCTP中的pFSHβ-eCTP为：iv)由SEQIDNO:5所示的氨基酸序列构成的蛋白；或v)SEQIDNO:5所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且同等功能的由iv)衍生的蛋白；或vi)与SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗昊澍，师磊，韩国，
申请(专利权)人：北京伟杰信生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11