本发明专利技术公开了一种利用纤维素固定化CBD‑EndoS融合酶的方法，属于固定化酶技术领域。本发明专利技术利用CBD‑EndoS的CBD标签将融合蛋白特异性固定于纤维素微球上，不同于传统固定化酶“先纯化后固定”，实现了一步固定纯化，将粗酶中的CBD‑EndoS蛋白固定在纤维素载体上，操作简单，方便快速，大大简化了固定化步骤。应用本发明专利技术的方法制备的固定化酶反复使用5次后，酶活仍保持在初始酶活88％以上；固定化酶于4℃条件下保存30天后，酶活仍保持在初始酶活90％以上。本发明专利技术有望实现工业化，有助于EndoS酶在抗体修饰研究领域的广泛应用。
A method for immobilization of CBD-EndoS fusion enzyme by cellulose
The invention discloses a method for immobilizing CBD_EndoS fusion enzyme with cellulose, belonging to the technical field of immobilized enzyme. The invention uses CBD EndoS CBD tag to fix the fusion protein on the cellulose microspheres, which is different from the traditional immobilized enzyme \purify first and then fix\, realizes one-step immobilization and purification, and fixes the CBD EndoS protein in the crude enzyme on the cellulose carrier. The operation is simple, convenient and fast, and greatly simplifies the immobilization steps. . The immobilized enzyme prepared by the method has been repeatedly used for five times, and the enzyme activity remains above 88% of the initial enzyme activity, and remains above 90% of the initial enzyme activity after being preserved at 4 C for 30 days. The invention is expected to realize industrialization and is conducive to the wide application of EndoS enzyme in the field of antibody modification.
【技术实现步骤摘要】
一种利用纤维素固定化CBD-EndoS融合酶的方法
本专利技术涉及一种利用纤维素固定化CBD-EndoS融合酶的方法，属于固定化酶
技术介绍
EndoS是一种来源于化脓链球菌的糖苷内切酶，可以高度特异性地水解抗体Fc结构域上的N糖链。因为抗体连接了先天免疫和适应性免疫，是许多人类免疫反应的中心因素，所以分析和调控EndoS的酶活性会对生物医学的众多领域产生影响。临床上，EndoS增强了化脓性链球菌逃避人类免疫反应的能力，因此Endo-S抑制剂能够用于改善炎症患者的症状。在治疗上，EndoS已经在动物模型中显示出巨大的治疗潜力，可以用于依赖自身抗体的多种自身免疫疾病的治疗；微调EndoS的特异性和活性是将其作为人类蛋白质治疗剂进一步发展的重要研究方向。在生物技术上，EndoS是一种独特的糖蛋白修饰酶，具有除去抗体上糖链的功能，而其突变体具有将糖链连接到抗体上的功能；利用EndoS及其突变体将均一的糖链连接到抗体上，产生均一糖基化抗体库，其对于发挥工程化抗体的全部潜力是至关重要的。目前EndoS的菌体表达量较低，无法满足未来大规模的抗体修饰研究的需要。酶的固定化是一种将酶限制在一定的载体上，可以连续催化合成产物，并且在反应结束后可以回收和再利用的技术。因此发展EndoS酶的固定化技术及其应用，有助于实现EndoS酶在抗体研究领域的广泛应用。纤维素是蛋白质固定化的理想载体，因为其具有低成本，惰性，稳定的优点，并且容易以不同形式获得。有研究表明，异源蛋白质融合纤维素结合域(CBD)后形成杂交蛋白质，其具有活性且能够和纤维素结合。因此，通过纤维素结合域将融合蛋白吸附到纤维素上可以作为一种简便的酶固定化技术。另一方面，纤维素载体及其标签还具有一步实现蛋白纯化和固定化的潜力。(参考文献BarbosaO,OrtizC,Berenguer-Murciaetal.Strategiesfortheone-stepimmobilization–purificationofenzymesasindustrialbiocatalysts[J].Biotechnologyadvances,2015,33(5):435-456.)
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种具有纤维素结合活性和糖苷内切活性的双功能融合蛋白CBD-EndoS，含有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。本专利技术的第二个目的是提供含有SEQIDNO.2所示CBD序列的表达载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述载体包括pET系列载体，如pET34b(+)、pET35b(+)等。在本专利技术的一种实施方式中，所述载体的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术的第三个目的是提供表达所述双功能融合蛋白CBD-EndoS的细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述细胞包括真菌细胞或细菌细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述细胞为重组大肠杆菌细胞，所述重组大肠杆菌是用所述的表达载体构建的重组质粒pCBD-EndoS转化至E.ColiBL21的重组细胞。本专利技术的第四个目的是提供所述双功能融合蛋白CBD-EndoS的构建方法，所述方法是将糖苷内切酶(EndoS)基因片段，定向克隆至含有纤维素结合域(CBD)的pET系列载体，构建具有纤维素结合活性和糖苷内切活性的双功能融合蛋白CBD-EndoS的载体，并转入E.ColiBL21感受态菌株，经IPTG低温诱导，获得高含量的CBD-EndoS融合蛋白。本专利技术的第五个目的是提供一种酶的固定化方法，所述方法是以纤维素微球作为固定化载体，利用SEQIDNO.2所示的CBD标签将融合蛋白特异性固定于纤维素微球上。在本专利技术的一种实施方式中，所述纤维素微球包括type20(particlesize:20μm)、type50(particlesize:50μm)、type101(form:fibers)。在本专利技术的一种实施方式中，所述融合蛋白包括具有糖苷键催化性质的酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述融合蛋白为CBD-EndoS，含有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。在本专利技术的一种实施方式中，所融合的糖苷内切酶包括但不限于性质和功能与EndoS，EndoH相似或相同的酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述固定是将纤维素微球直接与重组菌株pCBD-EndoS/E.ColiBL21的发酵粗酶液混合，室温下或4℃振荡反应半小时，将融合蛋白CBD-EndoS固定在纤维素微球上；再将纤维素微球用KPB缓冲液清洗后即可用于抗体修饰反应，反应后用KPB缓冲液清洗后可以长期保存或重复利用。在本专利技术的一种实施方式中，所述固定是在≥100mMNaCl、20～100mMK2HPO4/KH2PO4缓冲液中，pH4.5～8.0的溶液中，4～30℃固定至少20min。在本专利技术的一种实施方式中，所述固定是将纤维素微球放入KPB缓冲液预处理5～15min，离心弃上清，加入粗酶液，4～30℃振荡至少20min，即可将CBD-EndoS固定在纤维素载体上。在本专利技术的一种实施方式中，所述KPB缓冲液含有≥100mMNaCl、20～100mMK2HPO4/KH2PO4，pH4.5～8.0。本专利技术还要求保护所述固定化酶在食品、生物、医药、化工领域中的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用包括在同一个反应体系内进行一步或多步修饰抗体。本专利技术的优点和有益效果：本专利技术利用CBD-EndoS的CBD标签将融合蛋白特异性固定于纤维素微球上，不同于传统固定化酶“先纯化后固定”，实现了一步固定纯化，将粗酶中的CBD-EndoS蛋白固定在纤维素载体上，操作简单，方便快速，大大简化了固定化步骤。优化后的固定化体系为：100mMNaCl，50mMKPB，pH6.0，20℃，30min，在此条件下CBD-EndoS蛋白结合量为21mg/gcellulose。CBD融合表达的固定化方法可以保持酶的构型，保证酶的动力学性能和酶的稳定性。固定化酶反复使用5次后，酶活仍保持在初始酶活88％以上；固定化酶于4℃条件下保存30天后，酶活仍保持在初始酶活90％以上。同时，纤维素载体具有成本低，高度特异性等优点，降低了生产成本。本专利技术有望实现工业化，有助于EndoS酶在抗体修饰研究领域的广泛应用。附图说明图1是固定化CBD-EndoS凝胶电泳分析图，各泳道分别为：M：标准分子量蛋白；1：CBD-EndoS破壁粗酶液；2：纤维素固定化CBD-EndoS后剩余；3：6M尿素洗脱纤维素载体。图2为固定化CBD-EndoS水解SGP高效液相色谱图；图3是固定化CBD-EndoS水解利妥昔单抗凝胶电泳图，各泳道分别为：M：标准分子量蛋白；1：利妥昔单抗样品；2：固定化CBD-EndoS水解60min；图4为固定化CBD-EndoS的重复使用性检测结果；图5为固定化CBD-EndoS的稳定性检测结果；图6是不同纤维素载体固定化CBD-EndoS凝胶电泳图，个泳道分别为M：标准分子量蛋白；1：CBD-EndoS破壁粗酶液；2：SigmacellCellulose(Sigma)固定化CBD-EndoS；3：α-Cellulose(aladdin)固定化CBD-EndoS；4：Cellulose,Microcrystalline(San本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种双功能融合蛋白，其特征在于，具有纤维素结合活性和糖苷内切活性，并含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种双功能融合蛋白，其特征在于，具有纤维素结合活性和糖苷内切活性，并含有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。2.含有编码权利要求1所述双功能融合蛋白的基因的表达载体。3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，包括pET系列载体。4.表达权利要求1所述双功能融合蛋白的细胞。5.一种构建权利要求1所述双功能融合蛋白的方法，其特征在于，将编码糖苷内切酶的基因片段，定向克隆至含有纤维素结合域的pET系列载体，构建具有纤维素结合活性和糖苷内切活性的双功能融合蛋白CBD-EndoS的载体，并转入细胞中，培养细胞，收集...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴志猛，周志昉，赵恺，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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