一种抗菌融合肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种提供了一种抗菌融合肽，其肽链序列为：SISLLYGRKKRRQRRR。本发明专利技术还提供了另一种抗菌融合肽，其肽链序列为：YGRKKRRQRRRSISLL。本发明专利技术提供了上述抗菌融合肽的制备方法，根据目标抗菌融合肽的序列，从碳端到氮端将相应的氨基酸进行偶合；氮端氨基酸偶合完成后，脱保护基团洗涤吹干；切割后抽滤，使用冰乙醚充分洗涤和离心弃去上清液三次以上；干燥后的固体粉末用去离子水溶解后，分离纯化，收集主峰流出液，冷冻干燥后得目标抗菌融合肽。本发明专利技术还公开了抗菌融合肽在药品中的应用。本发明专利技术在抗癌肽的基础上得到了具有抗菌效果的融合肽，且抗菌融合肽的抗菌效果接近了强力抗菌药卡那霉素的抗菌作用，为进一步具体研发具有抗癌抗菌双重作用的药物提供了基础。

Antibacterial fusion peptide, preparation method and application thereof

The invention discloses an antibacterial fusion peptide, and its polypeptide chain sequence is SISLLYGRKKRRQRRR. The invention also provides another antibacterial fusion peptide with a sequence of YGRKKRRQRRRSISLL. The preparation method of the antimicrobial fusion peptide is provided, according to the sequence of the target antimicrobial fusion peptide, the corresponding amino acids are coupled from the carbon end to the nitrogen end; after the coupling of the amino acids at the nitrogen end is completed, the unprotected group is washed and dried; after cutting, the supernatant is sufficiently washed and centrifuged with ice ether to remove more than three times; The dried solid powders were dissolved in deionized water, separated and purified, and the effluent from the main peak was collected. After freeze-drying, the target antimicrobial fusion peptide was obtained. The invention also discloses the application of the antibacterial fusion peptide in the medicine. The antimicrobial effect of the antimicrobial fusion peptide is similar to that of Kanamycin, a strong antimicrobial drug, which provides a basis for further research and development of antitumor and antimicrobial drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种抗菌融合肽及其制备方法和应用
本专利技术涉及抗菌药
，尤其涉及一种抗菌融合肽。
技术介绍
现有的抗菌肽的来源有三种，天然物中提取、化学方法合成和生物方法合成。关于化学方法合成：氨基酸是两性物质，分子中一般含有氨基(-NH2)和羧基(-COOH)，是抗菌肽化学合成的基本原料。研究者通常将不参加缩合反应的氨基(-NH2)、羧基(-COOH)以及带有活泼基团的侧链保护起来，待到所有氨基酸都按照抗菌肽序列偶合完成之后，再进行脱保护反应。癌症是由于机体异常细胞的过度繁殖增生，从而损害健康、危及生命的疾病。抗癌药物具有抑制癌细胞增长的作用，但抗癌药物通常不能够抑制细菌增长，即不具备抗菌活性。癌症患者通常身体比正常人虚弱，更容易受到细菌感染。目前的医疗实践当中，对于受到细菌感染的癌症患者（或者有受到细菌感染可能的患者），在使用抗癌药物的同时，需要另外使用抗菌药物。药物的增多对于患者的健康具有负面的影响，如果能够研发出具有抗菌作用的抗癌药，则有望减少患者的用药量，减少用药对于患者健康的负面影响。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于乳腺癌抑制肽BRCA1(782-786，SISLL)的抗菌融合肽。为实现上述目的，本专利技术的抗菌融合肽为TAT（47-57）氮端连接BRCA1(782-786)的SISLL-TAT，其肽链序列为：SISLLYGRKKRRQRRR。本专利技术的目的还在于提供另一种基于乳腺癌抑制肽的抗菌融合肽。为实现上述目的，本专利技术的抗菌融合肽的肽序为TAT（47-57）碳端连接BRCA1(782-786)的TAT–SISLL，其肽链序列为：YGRKKRRQRRRSISLL。本专利技术的目的还在于提供一种上述抗菌融合肽的制备方法，依次按以下步骤进行：以Wang树脂为载体，Fmoc为氨基酸侧链保护基团，哌啶的DMF溶液为脱保护试剂，HBTU、HOBT和DIEA为氨基酸缩合剂，根据目标抗菌融合肽的序列，从碳（C-）端到氮（N-）端将相应的氨基酸进行偶合；直到氮端氨基酸偶合完成后，脱除氮端氨基酸的Fmoc保护基团，洗涤后吹干；然后加入由三氟乙酸、苯甲硫醚、乙二硫醇、水和苯酚配制而成的切割试剂，切割后抽滤，将滤液收集至冰乙醚中，-20℃下静置20小时，使沉淀物完全生成；离心弃去上清液；对沉淀物使用冰乙醚充分洗涤和离心弃去上清液三次以上；剩下的沉淀物经干燥，所得固体粉末进一步用去离子水溶解后，通过反相高效液相色谱（即RP-HPLC）分离纯化，收集主峰流出液，并冷冻干燥后获得相应的目标抗菌融合肽。所述反相高效液相色谱对抗菌融合肽的分离纯化的条件如下：抗菌融合肽SISLL-TAT：色谱柱AgilentZorbax300SB-C18，色谱柱直径9.4mm，长250mm，填料粒径5μm，色谱柱的温度25℃；检测波长220nm；流速1.0mL·min-1；流动相A相：0.1%TFA（三氟乙酸）的H2O；流动相B相：0.1%TFA的CH3CN（乙腈）；流动相梯度：10%~30%B相/0~20min（从0至20分钟流动相B的含量由10%增至30%）；收集保留时间为12.323min的流出液，冷冻干燥后得到白色粉末状的SISLL-TAT，产率76%。抗菌融合肽TAT-SISLL：色谱柱AgilentZorbax300SB-C18，色谱柱直径9.4mm，长250mm，填料粒径5μm，色谱柱的温度25℃；检测波长220nm；流速1.0mL·min-1；流动相A相：0.1%TFA（三氟乙酸）的H2O；流动相B相：0.1%TFA的CH3CN（乙腈）；流动相梯度：10%~30%B相/0~20min（从0至20分钟流动相B的含量由10%增至30%）；收集保留时间为12.223min的流出液，冷冻干燥后得到白色粉末状的TAT-SISLL，产率73%。上述抗菌融合肽在药品中的应用。本专利技术具有如下的优点：将抗癌肽与细胞穿膜肽融合在一起，能够使抗癌肽能够更容易进入细胞内部，从而提升抗癌肽的抗癌效果。但正常情况下，这种融合作用并不能使抗菌融合肽产生抗菌作用。本专利技术在抗癌肽的基础上得到了具有抗菌效果的融合肽，且抗菌融合肽的抗菌效果则接近了强力抗菌药卡那霉素的抗菌作用，为进一步具体研发具有抗癌抗菌双重作用的药物提供了基础，有利于减少癌症患者的用药量。附图说明图1是SISLL-TAT的1HNMR(D2O,400MHz)谱图；图2是SISLL-TAT的13CNMR(D2O,100MHz)谱图；图3是SISLL-TAT的ESI-MS(CH3OH)图；图4是TAT-SISLL的1HNMR(D2O,400MHz)谱图；图5是TAT-SISLL的13CNMR(D2O,100MHz)谱图；图6是TAT-SISLL的ESI-MS(CH3OH)图。具体实施方式实施例一如图1至图3所示，本专利技术提供了一种抗菌融合肽，为TAT（47-57）氮端连接BRCA1(782-786)的SISLL-TAT，其肽链序列为：SISLLYGRKKRRQRRR。实施例二如图4至图6所示，本专利技术提供了一种抗菌融合肽，抗菌融合肽的肽序为TAT（47-57）碳端连接BRCA1(782-786)的TAT–SISLL，其肽链序列为：YGRKKRRQRRRSISLL。本专利技术还提供了实施例一和实施例二中抗菌融合肽的制备方法，该方法是：以Wang树脂为载体，Fmoc为氨基酸侧链保护基团，哌啶的DMF溶液为脱保护试剂，HBTU、HOBT和DIEA为氨基酸缩合剂，根据目标抗菌融合肽的序列，从碳（C-）端到氮（N-）端将相应的氨基酸进行偶合；直到氮端氨基酸偶合完成后，脱除氮端氨基酸的Fmoc保护基团，洗涤后吹干；然后加入由三氟乙酸、苯甲硫醚、乙二硫醇、水和苯酚配制而成的切割试剂，切割后抽滤，将滤液收集至冰乙醚中，-20℃下静置20小时，使沉淀物完全生成；离心弃去上清液；对沉淀物使用冰乙醚充分洗涤和离心弃去上清液三次以上；剩下的沉淀物经干燥，所得固体粉末进一步用去离子水溶解后，通过反相高效液相色谱（即RP-HPLC）分离纯化，收集主峰流出液，并冷冻干燥后获得相应的目标抗菌融合肽。其中，反相高效液相色谱对抗菌融合肽的分离纯化的条件如下：抗菌融合肽SISLL-TAT的分离纯化条件：色谱柱AgilentZorbax300SB-C18，色谱柱直径9.4mm，长250mm，填料粒径5μm，色谱柱的温度25℃；检测波长220nm；流速1.0mL·min-1；流动相A相：0.1%TFA（三氟乙酸）的H2O；流动相B相：0.1%TFA的CH3CN（乙腈）；流动相梯度：10%~30%B相/0~20min（从0至20分钟流动相B的含量由10%增至30%）；收集保留时间为12.323min的流出液，冷冻干燥后得到白色粉末状的SISLL-TAT，产率76%；抗菌融合肽TAT-SISLL的分离纯化条件：色谱柱AgilentZorbax300SB-C18，色谱柱直径9.4mm，长250mm，填料粒径5μm，色谱柱的温度25℃；检测波长220nm；流速1.0mL·min-1；流动相A相：0.1%TFA（三氟乙酸）的H2O；流动相B相：0.1%TFA的CH3CN（乙腈）；流动相梯度：10%~30%B相/0~20min（从0至20分钟流动相B的含本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗菌融合肽，其特征在于：抗菌融合肽为TAT（47‑57）氮端连接BRCA1(782‑786)的SISLL‑TAT，其肽链序列为序列表中的序列3所示的SISLLYGRKKRRQRRR。

【技术特征摘要】
1.一种抗菌融合肽，其特征在于：抗菌融合肽为TAT（47-57）氮端连接BRCA1(782-786)的SISLL-TAT，其肽链序列为序列表中的序列3所示的SISLLYGRKKRRQRRR。2.一种抗菌融合肽，其特征在于：抗菌融合肽的肽序为TAT（47-57）碳端连接BRCA1(782-786)的TAT–SISLL，其肽链序列为序列表中的序列4所示的YGRKKRRQRRRSISLL。3.权利要求1或2中的抗菌融合肽的制备方法，其特征在于：以Wang树脂为载体，Fmoc为氨基酸侧链保护基团，哌啶的DMF溶液为脱保护试剂，HBTU、HOBT和DIEA为氨基酸缩合剂，根据目标抗菌融合肽的序列，从碳端到氮端将相应的氨基酸进行偶合；直到氮端氨基酸偶合完成后，脱除氮端氨基酸的Fmoc保护基团，洗涤后吹干；然后加入由三氟乙酸、苯甲硫醚、乙二硫醇、水和苯酚配制而成的切割试剂，切割后抽滤，将滤液收集至冰乙醚中，-20℃下静置20小时，使沉淀物完全生成；离心弃去上清液；对沉淀物使用冰乙醚充分洗涤和离心弃去上清液三次以上；剩下的沉淀物经干燥，所得固体粉末进一步用去离子水溶解后，通过反相高效液相色谱分离纯化，收集主峰流出液，并冷冻干燥后获得相应的目标...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕名秀，卢奎，买文鹏，刘广斌，王梦伟，彭露，
申请(专利权)人：河南工程学院，
类型：发明
国别省市：河南,41