一种白蛋白结合肽-人睫状神经营养因子融合蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种白蛋白结合肽‑人睫状神经营养因子融合蛋白及其制备方法和应用，所述融合蛋白包括白蛋白结合肽、人睫状神经营养因子和柔性肽段，所述融合蛋白不仅延长了重组人睫状神经营养因子的体内半衰期，还维持其活性。所述融合蛋白可在大肠杆菌中高效表达，纯化工艺简单，可用于大规模工业化生产制备药用级的融合蛋白纯品。与重组同源人睫状神经营养因子(rhCNTF)本身相比较，本发明专利技术所获得的ABD‑CNTF融合蛋白表现出血清半衰期显著延长，且保持人睫状神经营养因子的体外生物活性，从而改善了药物动力学和药效。

Albumin binding peptide human ciliary neurotrophic factor fusion protein and preparation method and application thereof

The present invention relates to an albumin-binding peptide-human ciliary neurotrophic factor fusion protein and its preparation method and application. The fusion protein includes an albumin-binding peptide, a human ciliary neurotrophic factor and a flexible peptide segment. The fusion protein not only prolongs the in vivo half-life of the recombinant human ciliary neurotrophic factor, but also maintains it. Its activity. The fusion protein can be highly expressed in E. coli, and the purification process is simple. The fusion protein can be used for large-scale industrial production to prepare medicinal grade pure products. Compared with the recombinant homologous human ciliary neurotrophic factor (rhCNTF), the fusion protein ABD_CNTF obtained by the present invention exhibits significantly prolonged serum half-life and maintains the biological activity of human ciliary neurotrophic factor in vitro, thereby improving the pharmacokinetics and pharmacodynamics.

【技术实现步骤摘要】
一种白蛋白结合肽-人睫状神经营养因子融合蛋白及其制备方法和应用
本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及一种长效生物药物开发领域，具体涉及一种白蛋白结合肽-人睫状神经营养因子融合蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
睫状神经营养因子(CilinaryNeuronotrophicFactor,CNTF)是一种多功能细胞因子。天然CNTF含200个氨基酸，分子量23KDa，等电点5.8左右，无N-糖基化位点和信号肽。CNTF可以促进包括运动神经元、感觉神经元、交感神经元、海马神经元等多种神经细胞和神经胶质细胞的生长和分化。临床试验表明，CNTF有望成为治疗帕金森(Parkinsondisease,PD)、阿尔茨海默(Alzheimer'sdisease,AD)、肌萎缩性脊髓侧索硬化(AmyotrophicLateralSclertosis,ALS)等神经退化性疾病的药物。最近研究表明CNTF可作用于位于下丘脑区域的受体，抑制机体对食物摄取的欲望，能使肥胖实验小鼠(ob/obmice)脂肪减少，进而体重降低。对于具有瘦蛋白(leptin)抵抗能力的食物诱导肥胖小鼠(diet-inducedobesity,DIO)模型，CNTF也能起到减少摄食、减轻体重的作用。针对这一结果进行在肥胖症领域进行实验，结果表明CNTF在体内可与下丘脑的特异性受体结合，抑制进食欲望且不会产生饥饿感，从而使体重减轻。研究发现，CNTF具有多种功能，能促使多种神经细胞的存活、营养肌肉、促进糖、脂代谢和调节能量平衡以及摄食行为。在神经系统、肌肉系统、肥胖症及其相关疾病的治疗中具有重要意义和广阔的临床前景。由于CNTF在治疗或预防肥胖症及其相关疾病中存在半衰期短的缺陷，限制了其在临床上的使用。因此，为了开发长效型CNTF制剂，目前现有技术使用PEG类聚合物对CNTF进行修饰，延长药物在体内作用的时间。以PEG修饰技术作为基础的长效策略存在修饰过程复杂、修饰产物分离困难和修饰后蛋白活性显著降低等问题。人血清白蛋白(HSA)是血液中最丰富的蛋白质，在人体内半衰期为19天。人血清白蛋白的长半衰期及稳定性为长效药物的设计提供了一种理想的载体。CN101200503A公开了一种血清白蛋白与干扰素的融合蛋白，该融合蛋白既有干扰素的特性，半衰期又得到了延长。当前基于白蛋白的长效策略主要是与白蛋白直接融合表达或通过化学偶联的方法与白蛋白结合在一起，基于这些策略已经取得良好的研究进展，并且相关产品已经相继被FDA批准。白蛋白结合肽(albuminbindingdomain，ABD)是一种与白蛋白具有高亲和力的多肽，包括源自微生物天然蛋白序列筛选获得的结构域，如链球菌G蛋白中与白蛋白结合的结构域以及人为设计获得的白蛋白抗体中抗原结合结构域。通过噬菌体展示技术筛选出的多种ABD肽均具备白蛋白结合位点，且具有极高的白蛋白亲和性能，在血浆循环中可与血浆白蛋白特异性结合，从而借助白蛋白在体内的长效性实现长时循环。通过融合表达或者化学修饰引入这种能与白蛋白结合的结构域，利用内源性的白蛋白作为载体可实现药物的长效性。ABD是一个小分子的肽段，与其它蛋白融合后仍然可以在原核表达系统中进行表达。因此，与直接融合或交联完整白蛋白分子相比，融合或交联ABD可以避免使用复杂的CHO等表达系统，同时也可避免外源性白蛋白所带来的安全隐患。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供一种白蛋白结合肽-人睫状神经营养因子融合蛋白及其制备方法和应用，所述融合蛋白具有高生物活性，体外活性保持较好，且具明显延长的体内半衰期。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种白蛋白结合肽-人睫状神经营养因子融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括白蛋白结合肽、人睫状神经营养因子和柔性肽段。本专利技术中，蛋白结合肽-人睫状神经营养因子融合蛋白通过柔性肽段将白蛋白结合肽与人睫状神经营养因子进行融合，两个蛋白起到了协同增效的作用，不仅保持了原人睫状神经营养因子的活性，还延长了融合蛋白在血清中的半衰期。根据本专利技术，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1-4之一所示，所述SEQIDNO.1-4所示的氨基酸序列如下：SEQIDNO.1：AFTEHSPLTPHRRDLCSRSIWLARKIRSDLTALTESYVKHQGLNKNINLDSADGMPVASTDRWSELTEAERLQENLQAYRTFHVLLARLLEDQQVHFTPTEGDFHQAIHTLLLQVAAFAYQIEELMILLEYKIPRNEADGMPINVGDGGLFEKKLWGLKVLQELSQWTVRSIHDLRFISSHQTGGGGGSGGGGSGGGGSLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALP；SEQIDNO.2：AFTEHSPLTPHRRDLCSRSIWLARKIRSDLTALTESYVKHQGLNKNINLDSADGMPVASTDRWSELTEAERLQENLQAYRTFHVLLARLLEDQQVHFTPTEGDFHQAIHTLLLQVAAFAYQIEELMILLEYKIPRNEADGMPINVGDGGLFEKKLWGLKVLQELSQWTVRSIHDLRFISSHQTGGGGGSGGGGSGGGGSLAEAKVLANRELDKYGV-SDYYKNLINNAKTVEGVKALIDEILAALP；SEQIDNO.3：AFTEHSPLTPHRRDLCSRSIWLARKIRSDLTALTESYVKHQGLNKNINLDSADGMPVASTDRWSELTEAERLQENLQAYRTFHVLLARLLEDQQVHFTPTEGDFHQAIHTLLLQVAAFAYQIEELMILLEYKIPRNEADGMPINVGDGGLFEKKLWGLKVLQELSQWTVRSIHDLRFISSHQTGGGGGSGGGGSGGGGSLKNAKEDAIAELKKAGITSDFYFNAINKAKTVEEVNALKNEILKAHA；SEQIDNO.4：AFTEHSPLTPHRRDLCSRSIWLARKIRSDLTALTESYVKHQGLNKNINLDSADGMPVASTDRWSELTEAERLQENLQAYRTFHVLLARLLEDQQVHFTPTEGDFHQAIHTLLLQVAAFAYQIEELMILLEYKIPRNEADGMPINVGDGGLFEKKLWGLKVLQELSQWTVRSIHDLRFISSHQTGGGGGSGGGGSGGGGSLAEAKVLALRELDKYGV-SDYYKDLIDKAKTVEGVKALIDEILAA.根据本专利技术，所述融合蛋白是通过柔性肽段将白蛋白结合肽的N末端连接到人睫状神经营养因子的C末端。根据本专利技术，所述白蛋白结合肽为能够特异性的结合人血清白蛋白都是可行的，本申请优选的氨基酸序列如SEQIDNO.5-8之一所示，所述SEQIDNO.5-8之一所示的氨基酸与人睫状神经营养因子结合的融合蛋白不仅保持了人睫状神经营养因子的活性，还延长了其在体内的半衰期，所述SEQIDNO.5-8所示的氨基酸序列如下：SEQIDNO.5：LAEAKVLANRELDKYGV本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种白蛋白结合肽‑人睫状神经营养因子融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括白蛋白结合肽、人睫状神经营养因子和柔性肽段。

【技术特征摘要】
1.一种白蛋白结合肽-人睫状神经营养因子融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括白蛋白结合肽、人睫状神经营养因子和柔性肽段。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1-4之一所示；优选地，所述融合蛋白是通过柔性肽段将白蛋白结合肽的N末端连接到人睫状神经营养因子的C末端；优选地，所述白蛋白结合肽的氨基酸序列如SEQIDNO.5-8之一所示。3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述人睫状神经营养因子的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示；优选地，所述人睫状神经营养因子还包括人睫状神经营养因子突变体；优选地，所述人睫状神经营养因子突变体的氨基酸序列与SEQIDNO.9所示的氨基酸序列有90％以上的相似度；优选地，所述柔性肽段含有1-30个氨基酸；优选地，所述氨基酸为甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸中的任意一种或至少两种的组合；优选地，所述柔性肽段为GGGGS，(GGGGS)2，(GGGGS)3，(GGGGS)4，GSGGGS(GGGGS)n中的任意一种，其中，n为1-4的整数，优选为GSGGGS(GGGGS)2。4.一种核酸片段，其特征在于，所述核酸片段编码如权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白。5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求4所述的核酸片段。6.一种重组的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘永东，徐龙福，张纯，苏志国，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11