一种促血小板生成素的融合蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于基因工程制药领域，涉及一种促血小板生成素的融合蛋白及其制备方法和应用，具体涉及一种酵母偏好密码子编码的促血小板生成素模拟肽(Thrombopoietin Mimetic Peptide，TMP)二联体与人血清白蛋白分子(Human serum Albumin，HSA)的融合蛋白及其制备方法和应用。所述融合蛋包含一个HSA分子和一个酵母偏好密码子编码的TMP二联体，其中，HSA分子位于融合蛋白的N‑末端，酵母偏好密码子编码的TMP二联体位于融合蛋白的C‑末端。所述融合蛋白能在酵母体内高水平的稳定表达，可应用于工业生产；同时，该融合蛋白具有显著促进血小板生成的特性，在人体内具有较长的半衰期，可用于制备治疗多种原发性或继发性血小板减少症等疾病的药物。

A thrombopoietin fusion protein and its preparation method and Application

The invention belongs to the field of genetic engineering pharmacy, and relates to a fusion protein of thrombopoietin, a preparation method and application thereof, in particular to a thrombopoietin mimetic peptide (TMP) dimer encoded by yeast preference codon and a human serum albumin molecule. HSA) fusion protein and its preparation method and application. The fusion egg comprises a HSA molecule and a TMP dimer encoded by yeast preferred codon, wherein the HSA molecule is located at the N_terminal of the fusion protein, and the TMP dimer encoded by yeast preferred codon is located at the C_terminal of the fusion protein. The fusion protein can be stably expressed in yeast at a high level and can be used for industrial production; meanwhile, the fusion protein has the characteristics of promoting platelet production and has a long half-life in human body, and can be used for preparing drugs for treating various diseases such as primary or secondary thrombocytopenia.

【技术实现步骤摘要】
一种促血小板生成素的融合蛋白及其制备方法和应用
本专利技术属于基因工程制药领域，涉及一种促血小板生成素的融合蛋白及其制备方法和应用，具体涉及一种酵母偏好密码子编码的促血小板生成素模拟肽(ThrombopoietinMimeticPeptide，TMP)二联体与人血清白蛋白分子(HumanserumAlbumin，HSA)的融合蛋白。
技术介绍
在临床上常会遇到由各种原因引起的原发性和继发性血小板减少症，如原发性血小板减少性紫癜、再生障碍性贫血以及肿瘤化/放疗造成的血小板减少等。对于这类疾病，比较适合应用长效升血小板药物进行救治，一方面，可以减少用药次数，减少病人的针痛之苦；另一方面，可以减少药物用量，降低治疗费用。血小板由巨核细胞产生，促进巨核细胞的增殖、分化是提高血小板水平的主要手段。促血小板生成素(Thrombopoietin，TMP)，又称巨核细胞生长发育因子(MGDF)，是骨髓巨核细胞增殖、分化和血小板生成的最重要调控因子。1994年TMP基因缺少注释被首次成功克隆后不久，人们即研制出一种聚乙二醇(PEG)化的重组功能型TMP基因工程产品-PEG-rHuMGDF。动物实验结果表明，PEG-rHuMGDF不仅具有突出的促血小板生成活性，而且在体内具有较长的半衰期，单次应用即可达到显著升高血小板的效果。然而，在临床试验过程中人们发现，一些健康受试者在接受该药物治疗后所产生的抗体与内源性TMP存在交差中和反应，导致受试者出现血小板减少，从而使得PEG-rHuMGDF乃至重组人TMP的研制在1998年时即被美国FDA叫停。受其影响，在美、欧、日本等国家至今重组人TMP都未被批准进入临床。人血清白蛋白分子(AlbuminHuman，HSA)是血浆中的主要蛋白成分，约占血浆总蛋白的50-60％。HSA分子是一种非糖基化单链蛋白，共由585个氨基酸残基组成，其分子量为66.5kDa(A.Dugaiczyketal.，PNAS，1982，79：71-75)，血浆半衰期长达两周以上。HSA分子在宿主细胞中是以一种原肽形式合成的，其中含24个氨基酸残基组成的信号肽和前肽，在转运和分泌过程中信号肽和前肽被切除。HSA分子是一个稳定的惰性蛋白，可以作为药物载体。HSA分子以下同已成功地在多宿主中表达(EP330451和EP361991)，尤其在酵母细胞中可实现HSA分子较高水平的稳定表达。当目的多肽与HSA分子融合表达时不仅可以提高多肽药物的稳定性，还可以增加多肽药物在体内的半衰期。专利号CN201310084212.8的二聚体化融合蛋白的制备及应用中公开了二聚体化促血小板生成素(TPO)模拟肽TMP二联体-人血清白蛋白分子融合蛋白的制备及应用，但是其存在融合蛋白表达效果不理想的问题，为了提高表达产量、增强融合蛋白的生物活性，本专利技术采用了酵母偏好密码子编码促血小板生成素模拟肽TMP二联体的策略。基于上述研究现状，本专利技术现提供一种促血小板生成素的融合蛋白，所述的促血小板生成素模拟肽TMP二联体是由酵母偏好密码子编码而成的，所述融合蛋白能在酵母体内高水平的稳定表达，可应用于工业生产；同时，该融合蛋白具有显著促进血小板生成的特性，在人体内具有较长的半衰期。本专利技术同时提供该融合蛋白的制备方法和应用。重组蛋白的异源表达受到基因自身序列特征如密码子偏好性、GC含量、mRNA二级结构、mRNA稳定性等因素的影响。研究表明同义密码子的更换能够影响蛋白质翻译延伸的速率[1-2]，说明密码子的优化可能会对重组蛋白的表达起到适得其反的影响。另一方面，重组蛋白的表达还受到宿主、培养条件、分泌途径、启动子等因素的影响，现行的基因优化理论和设计方法还不成熟，存在着各种各样的局限性，基因优化策略对提高重组蛋白的表达量是必要条件，而不是充分条件。综上所述，通过酵母偏好密码子改造从而改良基因工程菌株表达量的策略在实际生产应用中存在着极大的不确定性，针对不同的目的基因进行改造，最终的结果是无法预知的。参考文献：[1]KomarAA,LesnikT,ReissC.Synonymouscodonsubstitutionsaffectribosometrafficandproteinfoldingduringinvitrotranslation.FEBSLett,1999,462(3):387-391.[2]TrinhR,GurbaxaniB,MorrisonSL,etal.Optimizationofcodonpairusewithinthe(GGGGS)3linkersequenceresultsinenhancedproteinexpression.MolImmunol,2004,40(10):717-722.
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种促血小板生成素的融合蛋白，该融合蛋白半衰期长，能在宿主体内高水平稳定表达。本专利技术的另一个目的是提供上述融合蛋白的制备方法。本专利技术的另一个目的是提供上述融合蛋白的应用。本专利技术所述的上述目的是通过以下技术方案实现的：本专利技术公开的一种促血小板生成素的融合蛋白，包括人血清白蛋白HSA分子、促血小板生成素模拟肽TMP二联体，所述的人血清白蛋白HSA分子的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示，或该氨基酸序列经突变后具有同样功能的序列，编码所述HSA分子的氨基酸序列的DNA序列如SEQIDNO：3所示，所述的促血小板生成素模拟肽TMP二联体的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，或该氨基酸序列经突变后具有同样功能的序列，促血小板生成素模拟肽TMP二联体是由一个酵母偏好密码子编码而成的，编码所述促血小板生成素模拟肽TMP二联体的氨基酸序列的DNA序列如SEQIDNO：1所示，该融合蛋白还包括可形成二聚体化结构域的肽段。本专利技术公开的一种促血小板生成素的融合蛋白，可形成二聚体化结构域的肽段中含有至少两个半胱氨酸。本专利技术公开的一种促血小板生成素的融合蛋白，可形成二聚体化结构域的肽段中含有两个半胱氨酸。本专利技术公开的一种促血小板生成素的融合蛋白，可形成二聚体化结构域的肽段为H肽段，其氨基酸序列如SeqIDNo:8所示。本专利技术公开的一种促血小板生成素的融合蛋白，可形成二聚体化结构域的肽段为H肽段和选自fip结构域的肽段，H肽段的氨基酸序列如SeqIDNo:8所示，选自fip结构域的肽段的氨基酸序列如SeqIDNo:10所示。本专利技术公开的一种促血小板生成素的融合蛋白，其中HSA分子连接于融合蛋白的C-末端，结构式表示为HSA-L3-H-L4-TMP-L1-TMP，L1、L3、L4表示肽接头，L1的氨基酸序列为GGPSG，L3的氨基酸序列为GGGGSGL，L4的氨基酸序列为EFGGGGS，H表示可形成二聚体化结构域的H肽段。本专利技术公开的一种促血小板生成素的融合蛋白，其中HSA分子位于融合蛋白的N-末端，结构式表示为TMP-L1-TMP-L2-H-fip-HSA，L1和L2表示肽接头，L1的氨基酸序列为GGPSG，L2的氨基酸序列为GGGGSRS，H表示可形成二聚体化结构域的H肽段，fip表示选自fip结构域的肽段；所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：6所示，编码所述融合蛋白的核苷酸序列的DNA序列如SEQIDNO：5所示。本专利技术公本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种促血小板生成素的融合蛋白，包括人血清白蛋白HSA分子、促血小板生成素模拟肽TMP二联体，所述的HSA分子的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，或该氨基酸序列经突变后具有同样功能的序列，编码所述HSA分子的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO：3所示，所述的促血小板生成素模拟肽TMP二联体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或该氨基酸序列经突变后具有同样功能的序列，其特征在于，所述的促血小板生成素模拟肽TMP二联体是由一个酵母偏好密码子编码而成的，编码所述促血小板生成素模拟肽TMP二联体的氨基酸序列的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，该融合蛋白还包括可形成二聚体化结构域的肽段。

【技术特征摘要】
1.一种促血小板生成素的融合蛋白，包括人血清白蛋白HSA分子、促血小板生成素模拟肽TMP二联体，所述的HSA分子的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示，或该氨基酸序列经突变后具有同样功能的序列，编码所述HSA分子的氨基酸序列的DNA序列如SEQIDNO：3所示，所述的促血小板生成素模拟肽TMP二联体的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，或该氨基酸序列经突变后具有同样功能的序列，其特征在于，所述的促血小板生成素模拟肽TMP二联体是由一个酵母偏好密码子编码而成的，编码所述促血小板生成素模拟肽TMP二联体的氨基酸序列的DNA序列如SEQIDNO：1所示，该融合蛋白还包括可形成二聚体化结构域的肽段。2.根据权利要求1所述的一种促血小板生成素的融合蛋白，其特征在于，所述的可形成二聚体化结构域的肽段中含有至少两个半胱氨酸。3.根据权利要求1所述的一种促血小板生成素的融合蛋白，其特征在于，所述的可形成二聚体化结构域的肽段中含有两个半胱氨酸。4.根据权利要求3所述的一种促血小板生成素的融合蛋白，其特征在于，所述的可形成二聚体化结构域的肽段为H肽段，其氨基酸序列如SeqIDNo:8所示。5.根据权利要求3所述的一种促血小板生成素的融合蛋白，其特征在于，可形成二聚体化结构域的肽段为H肽段和选自fip结构域的肽段，H肽段的氨基酸序列如SeqIDNo:8所示，选自fip结构域的肽段的氨基酸序列如SeqIDNo:10所示。6.根据权利要求4所述的一种促血小板生成素的融合蛋白，其特征在于，所述HSA分子连接于融合蛋白的C-末端，结构式表示为HSA-L3-H-L4-TMP-L1-TMP，L1、L3、L4表示肽接头，L1的氨基酸序列为GGPSG，L3的氨基酸序列为GGGGSGL，L4的氨基酸序列为EFGGGGS，H表示可形成二聚体化结构域的H肽段。7.根据权利要求5所述的一种促血小板生成素的融合蛋白，其特征在于，所述HAS分子位于融合蛋白的N-末端，结构式表示为TMP-L1-TMP-L2-H-fip-HSA，L1和L2表示肽接头，L1的氨基酸序列为GGPSG，L2的氨基酸序列为GGGGSRS，H表示可形成二聚体化结构域的H肽段，fip表示选自fip结构域的肽段；所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：6所示，编码所述融合蛋白的核苷酸序列的DNA序列如SEQIDNO：5所示。8.权利要求6所述的一种促血小板生成素的融合蛋白形成的二聚体化融合蛋白。9.权利要求7所述的一种促血小板生成素的融合蛋白形成的二聚体化融合蛋白。10.一种促血小板生成素的融合蛋白，包括人血清白蛋白HAS分子、促血小板生成素模拟肽TMP二联体，所述的人血清白蛋白HAS分子的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示，或该氨基酸序列经突变后具有同样功能的序列，编码所述HAS分子的氨基酸序列的DNA序列如SEQIDNO：3所示，所述的促血小板生成素模拟肽TMP二联体的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示，或该氨基酸序列经突变后具有同样功能的序列，其特征在于，所述的促血小板生成素模拟肽TMP二联体是由一个酵母偏好密码子编码而成的，编码所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李红玉，张丽芸，王梅竹，支德娟，李洋，赵晶，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃,62