IgG样长效免疫融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种IgG样长效免疫融合蛋白及其应用。本发明专利技术所提供的IgG样长效免疫融合蛋白由效应分子和IgG抗体恒定区组成，所述效应分子通过连接肽与所述IgG抗体恒定区相连；所述效应分子为能在体内发挥生理学功能的蛋白；所述IgG抗体恒定区为IgG抗体去除两个重链可变区和两个轻链可变区后的结构。本发明专利技术所提供的IgG样免疫融合蛋白，其在保证了与靶向分子具有较高亲和力以及具有较好体内活性的前提下，可以有效延长蛋白药物(效应分子)的生物半衰期，远远好于于同类的Fc免疫融合蛋白。本发明专利技术所提供的这种IgG样长效免疫融合蛋白可用于糖尿病、肿瘤、自身免疫性疾病和内分泌等多种疾病的治疗。

IgG like long-acting immune fusion protein and its application

The present invention discloses a IgG like long-acting immune fusion protein and its application. The long-acting IgG-like immunofusion protein provided by the present invention is composed of an effector molecule and a constant region of IgG antibody. The effector molecule is connected to the constant region of the IgG antibody by a connecting peptide; the effector molecule is a protein capable of performing physiological functions in vivo; and the constant region of the IgG antibody removes two variable regions of heavy chain and the constant region of the IgG antibody. The structure of the two light chain variable regions. The IgG-like immunofusion protein provided by the invention can effectively prolong the biological half-life of the protein drug (effector molecule) on the premise of ensuring high affinity with the target molecule and good in vivo activity, and is much better than the similar Fc immunofusion protein. The IgG-like long-acting immune fusion protein can be used for the treatment of diabetes, tumor, autoimmune diseases and endocrine diseases.

【技术实现步骤摘要】
IgG样长效免疫融合蛋白及其应用
本专利技术属于生物
，涉及一种IgG样长效免疫融合蛋白及其应用。
技术介绍
重组蛋白药物是生物技术药物中很重要的一类，临床上一般通过静脉和皮下注射给药。经静脉和皮下注射后常伴有蛋白质降解，导致活性降低，生物利用度低；分子量较小者(小于60kD)甚至可以通过肾小球过滤到尿中，因而要达到需要的血药浓度和治疗效果需要反复给药，有的需要一天注射2-3次，不仅给患者带来不便，降低患者顺应性，从而影响疗效。因此临床上需要研制长效的重组蛋白药物。目前延长蛋白药物半衰期的方法主要有：构建突变体通过构建突变体延长蛋白药物半衰期，常用方法有：1、增加蛋白药物的糖基化程度，使在蛋白药物表面形成保护，，阻碍了蛋白酶对蛋白药物的降解作用，增加蛋白质稳定性，同时使蛋白药物分子量增大，减少了肾小球滤过。已经研制成功并上市的药物如重组人EPO突变体(Amgen公司的Aranesp)和重组人胰岛素的突变体(Aventis公司的Lantus)。Aranesp采用定点突变技术，N连接的寡糖链从原来的3条增加到5条，从而使分子量从原来的30kDa增加到50kDa，半衰期由原来的4-13h延长到平均49h。2、通过形成缓释的微沉淀物，使释放游离型药物的时间延长。Lantus是从大肠杆菌K12株表达的重组人胰岛素的突变体，在人胰岛素A链第21个位点将Asp突变成Gly；在B链碳端最后第30个位点加两个Arg，使胰岛素等电点PI由原来的pH4.0变为pH6.7。这种突变使其在酸性环境下为完全澄清溶液，一旦注入皮下组织(pH值提高)则因为等电点特性，变成不溶的微沉淀物，可持续释放，与重组人胰岛素皮下注射后4-8h的持续时间相比，体内浓度相对恒定24小时以上。PEG化修饰PEG化(PEGylation)，即聚乙二醇(polyethylene,PEG)共价修饰蛋白质。PEG化蛋白药物主要通过增加蛋白质的分子量，降低药物从肾小管过滤，并且PEG可以作为屏障挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇，减少免疫原性，减少体内清除率，PEG的屏障作用还可以保护蛋白质不易被蛋白酶水解，PEG化的这些特点均有利于延长蛋白药物的半衰期。目前已上市的PEG化的蛋白药物如PEG化的天冬酰胺酶(Enzon公司的Oncaspar)、PEG化的IFNα2b(Schering公司的PEGIntron)、PEG化的IFNα2a(Roche公司的Pegasys)和PEG化的G-CSF(Amgen公司的Neulasta)。血清白蛋白融合人血清，白蛋白(humanserumalbumin,HSA)是有585个氨基酸残基的单链无糖基化的球形蛋白质，分子量65kDa，大多数治疗用的蛋白和多肽半衰期一般较短，而HSA有将近长达19天的血清半衰期。临床试验结果表明，Albuferonα(HSA/IFNα融合蛋白)平均半衰期148小时，比Pegasys平均半衰期80小时(50-140小时)和PEGIntron平均半衰期40小时(22-60小时)更长。Albutropin是由HSA基因和重组人生长激素(rHGH)基因融合表达的蛋白。在猴子中，皮下注射albutropin(0.3mg/kg)和HGH(0.3mg/kg)相比，半衰期延长6倍，清除率慢8倍。人Fc制备的融合蛋白。白蛋白融合蛋白和Fc制备的融合蛋白的主要通过二种机制提高药物在体内的生物半衰期，一个是增加其分子量的大小，使其不易被肾小管过滤出去；另一个是通过与新生儿Fc受体(neonatalFcreceptor,FcRn)的结合保护目标蛋白不轻易在血中清除(RathT,BakerK,DumontJA,etal.CritRevBiotechnol.2015Jun；35(2):235-54)。FcRn受体由fcgrt基因编码，也被称为Brambell受体，是通过非共价键与β2m微球蛋白形成异源二聚体的MHCI类样的受体分子。FcRn受体与白蛋白和免疫球蛋白的结合有严格的pH依赖性，FcRn在生理条件下(pH7.4)不与白蛋白和免疫球蛋白结合。但当白蛋白和免疫球蛋白通过胞饮途径内吞到细胞内，在酸性的溶酶体内(pH6.0-6.5)，FcRn与白蛋白和免疫球蛋白的亲和力提高，形成复合物，FcRn保护白蛋白和免疫球蛋白不被降解，并通过膜质循环，将白蛋白和免疫球蛋白再次释放到胞外。白蛋白和免疫球蛋白与FcRn结合可保护它们被代谢掉，延长二者的生物半衰期。目前，上市的白蛋白和免疫球蛋白产品有abatacept、aflibercept、belatacept、conbercept(四川康弘)、dulaglutide、etanercept和albutrepenonacogalfa等，其中etanercept和aflibercept为重磅炸弹级药物，2016年etanercept全球销售额达88.74亿美元，aflibercept达50亿美元，conbercept(四川康弘)在中国销售额有望突破5亿人民币。然而，这些Fc免疫融合蛋白具有一个普遍的缺点，那就是生物半衰期较短。
技术实现思路
为了有效解决现有延长蛋白药物生物半衰期方法的不足，本专利技术设计了IgG样免疫融合蛋白，其可以有效延长蛋白药物(效应分子)的生物半衰期，远远好于于同类的Fc免疫融合蛋白。本专利技术所提供的IgG样免疫融合蛋白，具体是由效应分子和IgG抗体恒定区组成，所述效应分子通过连接肽与所述IgG抗体恒定区相连；所述效应分子为能在体内发挥生理学功能的蛋白；所述IgG抗体恒定区为IgG抗体去除两个重链可变区和两个轻链可变区后的结构。即，所述IgG样免疫融合蛋白，与免疫球蛋白一样，是一类由两条轻链和两条重链组成的四肽链结构，重链之间和重、轻链之间由二硫键连接，其构象与英文大写字母Y形状类似。轻链型别可为κ和λ型，包含轻链的恒定区(CL)。重链类别可为IgG1，IgG2和IgG4，包含重链的恒定区(CH1、CH2和CH3)。其中，所述连接肽的氨基酸序列可选自如下中任一：AKTTPKLEEGEFSEAR(序列1)；AKTTPKLEEGEFSEARV(序列2)；AKTTPKLGG(序列3)；SAKTTPKLGG(序列4)；SAKTTP(序列5)；RADAAP(序列6)；RADAAPTVS(序列7)；RADAAAAGGPGS(序列8)；RADAAAA(序列9)；SAKTTPKLEEGEFSEARV(序列10)；ADAAP(序列11)；DAAPTVSIFPP(序列12)；TVAAP(序列13)；TVAAPSVFIFPP(序列14)；QPKAAP(序列15)；QPKAAPSVTLFPP(序列16)；AKTTPP(序列17)；AKTTPPSVTPLAP(序列18)；AKTTAP(序列19)；AKTTAPSVYPLAP(序列20)；ASTKGP(序列21)；ASTKGPSVFPLAP(序列22)；GGGGSGGGGSGGGGS(序列23)；GENKVEYAPALMALS(序列24)；GPAKELTPLKEAKVS(序列25)；GHEAAAVMQVQYPAS(序列26)。所述效应分子通过所述连接肽以下述8种方式中的任一种与所述IgG抗体恒定区相连：方式1：所述效应分子通过所述连接肽分别连接本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.IgG样免疫融合蛋白，由效应分子和IgG抗体恒定区组成，所述效应分子通过连接肽与所述IgG抗体恒定区相连；所述效应分子为能在体内发挥生理学功能的蛋白；所述IgG抗体恒定区为IgG抗体去除两个重链可变区和两个轻链可变区后的结构。

【技术特征摘要】
1.IgG样免疫融合蛋白，由效应分子和IgG抗体恒定区组成，所述效应分子通过连接肽与所述IgG抗体恒定区相连；所述效应分子为能在体内发挥生理学功能的蛋白；所述IgG抗体恒定区为IgG抗体去除两个重链可变区和两个轻链可变区后的结构。2.根据权利要求1所述的IgG样免疫融合蛋白，其特征在于：所述连接肽的氨基酸序列选自序列表中序列1至序列26中任一。3.根据权利要求1或2所述的IgG样免疫融合蛋白，其特征在于：所述效应分子通过所述连接肽以下述八种方式中的任一种与所述IgG抗体恒定区相连：方式1：所述效应分子通过所述连接肽分别连接于所述IgG抗体恒定区的两条重链和两条轻链的N端；方式2：所述效应分子通过所述连接肽连接于所述IgG抗体恒定区的两条重链的C端，不连接轻链；方式3：所述效应分子通过所述连接肽连接于所述IgG抗体恒定区的两条轻链的N端，不连接重链；方式4：所述效应分子通过所述连接肽连接于所述IgG抗体恒定区的两条轻链的C端，不连接重链；方式5：所述效应分子通过所述连接肽分别连接于所述IgG抗体恒定区的两条重链的N端，不连接轻链；方式6：所述效应分子通过所述连接肽分别连接于所述IgG抗体恒定区的两条重链的N端和两条轻链的C端；方式7：所述效应分子通过所述连接肽分别连接于所述IgG抗体恒定区的两条重链和两条轻链的C端；方式8：所述效应分子通过所述连接肽分别连接于所述IgG抗体恒定区的两条轻链的N端和两条重链C端。4.根据权利要求1-3中任一所述的IgG样免疫融合蛋白，其特征在于：所述效应分子作用的靶向分子为糖尿病治疗的靶向分子、自身免疫性疾病治疗的靶向分子、肿瘤治疗的靶向分子或内分泌治疗的靶向分子。5.根据权利要求4所述的IgG样免疫融合蛋白，其特征在于：所述糖尿病治疗的靶向分子为胰高血糖素样肽1受体、成纤维细胞生长因子受体或其他靶向分子；所述自身免疫性疾病治疗的靶向分子选自如下任一种：肿瘤坏死因子α、IL-1、IL-4、IL-5、IL-8、IL-13、IL-17、IL-23、CD80、CD86、CD2、CD110、CD257、B淋巴细胞刺激因子，以及其他靶向分子；所述肿瘤治疗的靶向分子选自如下任一种：血管内皮生长因子A、Fas配体、生长分化因子2、Wnt、骨形态发生蛋白11、激活素A，以及其他靶向分子；所述内分泌治疗的靶向分子为生长激素受体或甲状旁腺激素受体。6.根据权利要求5所述的IgG样免疫融合蛋白，其特征在于：作用于糖尿病治疗靶向分子胰高血糖素样蛋白1受体的所述效应分子为GLP-1或GLP-1类似物；作用于糖尿病治疗靶向分子成纤维细胞生长因子受体的所述效应分子为成纤维细胞生长因子21；作用于自身免疫性疾病治疗的靶向分子肿瘤坏死因子α的所述效应分子为肿瘤坏死因子受体1或肿瘤坏死因子受体2；作用于自身免疫性疾病治疗的靶向分子CD80和CD86的所述效应分子为细胞毒T淋巴细胞相关抗原4；作用于自身免疫性疾病治疗的靶向分子CD2的所述效应分子为CD58；作用于自身免疫性疾病治疗的靶向分子B淋巴细胞刺激因子的所述效应分子为穿膜蛋白活化物；作用于自身免疫性疾病治疗的靶向分子CD257的所述效应分子为CD268；作用于自身免疫性疾病治疗的靶向分子CD11...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡品良，何芸，邹敬，洪伟东，宋凌云，杨泽荣，
申请(专利权)人：北京比洋生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11