本发明专利技术公开了一种人生长抑素十四肽与人血清白蛋白的融合蛋白，包括与人生长抑素十四肽至少85％序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区或人血清白蛋白的部分氨基酸序列第二区；与人生长抑素十四肽同源的第一区位于融合蛋白的N末端，与人血清白蛋白同源的第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或与人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区位于融合蛋白的N末端，与人生长抑素十四肽至少85％序列同源的第一区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。本发明专利技术的有益效果为：延长了天然人生长抑素十四肽分子在血液循环系统内的滁留时间，可应用于治疗因生长激素分泌过剩所引起的各种疾病，用于治疗胃肠道内分泌紊乱引起的疾病，用于抑制表达SSTRs和不表达SSTRs肿瘤的生长，用于降低胃肠道辐射损伤导致的死亡率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于长效融合蛋白药物
，具体涉及人生长抑素十四肽与人血清白蛋白的融合蛋白。
技术介绍
生长抑素(somatostatin, SST)是一种环状的多肽类激素，是Brazeau 等在1973年从羊下丘脑分离提纯的一种生长激素释放抑制因子(somatotropin release-inhibiting factor, SRIF)，主要有 14 肽(SST-14)和沘 Jft(SST28)两种天然形式。SST通过与靶细胞膜上的特异性受体(Somatostatin receptors, SSTRs)结合而发挥多种生物活性。SSTRs共有5个分子亚型，SSTRl 5，其中SSTR2又存在SSTR2A和SSTR2B 两种变异体，它们都以类似的亲和力与天然SST-14和SSD8结合。SST除能抑制生长激素外，几乎对机体所有的生理性内外分泌反应均有抑制作用，而且能广泛抑制细胞的增殖活性。近年来的研究发现，SST及其类似物具有抑制肿瘤生长的活性，它们不仅能抑制内分泌肿瘤的增殖，而且对许多其他实体肿瘤，如乳腺癌、大肠癌、肝癌、肺癌等也具有抑制作用。SST-14是首先发现于下丘脑中的活性物质，结构为一环状14肽，第3位和14位的半胱氨酸之间以二硫键相结合，通常所说的SST是指SST-14。SST-14的作用时间短暂， 血浆半衰期仅为3分钟，停药后易出现激素水平的反跳高分泌现象，因而缺乏临床药用价值。虽然人们设计了一系列具有较好的，机体可耐受的SST类似物，如奥曲肽、伐普肽、兰瑞肽等，使其血浆半衰期延长至120分钟，但这些类似物仅与部分受体有高亲和力，在生理功能的发挥上远不如天然SST。人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)作为人体血浆的主要成分，具有无酶活性和免疫原性、分子量大、半衰期长(大约23天)等优点，并且是许多内源因子和外源药物的载体。采用以HSA为载体的融合蛋白技术，将药物蛋白与HSA分子融合表达，一方面增加了药物蛋白的分子量，降低了肾脏的排泄速率；另一方面，融合的蛋白分子表面产生空间位阻效应，减低血液中蛋白水解酶对药物蛋白的水解作用，从而有效地延长了药物蛋白分子在循环系统内的滁留时间。通过改变药物的药代动力学特性，使得药物的血浆浓度更加稳定，药物在体内维持的时间更长，从而达到提高药物疗效的效果。基因串联技术是将数个目的基因首尾相连随机串联起来，常常用在需要获取足够的DNA片段或基因的表达产物的情况下，由于SST在人体内是通过受体与配体相互结合的方式产生生理作用，增加药物分子中配体的数目，理论上无疑会使药物与配体结合的机会增加，活性增强。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述缺陷，提供了一种人生长抑素十四肽与人血清白蛋白的融合蛋白，包括与人生长抑素十四肽至少85%序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少85%序列同源的第二区或人血清白蛋白的部分氨基酸序列第二区；所述与人生长抑素十四肽同源的第一区位于融合蛋白的N末端，所述与人血清白蛋白同源的第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述与人血清白蛋白至少85%序列同源的第二区位于融合蛋白的N末端，所述与人生长抑素十四肽至少85%序列同源的第一区位于融合蛋白的 C末端，中间不加任何连接肽。所述的人生长抑素十四肽至少85%序列同源的第一区为串联体形式。所述的人生长抑素十四肽至少85%序列同源的第一区为单体、二联体或三联体。所述融合蛋白的第二区由人血清白蛋白部分结构域组成或经人血清白蛋白部分结构域重排后的人血清白蛋白组成。所述融合蛋白，是如下a)或b)的蛋白质a)由序列表中序列2或4的氨基酸残基序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2或4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能延长的体内半衰期的由a)衍生的蛋白质。本专利技术的另一个目的是提供了由人生长抑素十四肽和人血清白蛋白组成的融合蛋白的编码基因。所述的编码基因，是如下1)或2)的基因1)其核苷酸序列是序列表中的序列1或3；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述融合蛋白的DNA分子。本专利技术的第三个目的是提供含有所述融合蛋白编码基因的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。本专利技术的第四个目的是提供一种表达所述的由人生长抑素十四肽和人血清白蛋白组成的融合蛋白的方法，是将含有所述融合蛋白编码基因的重组表达载体导入宿主，表达得到融合蛋白；所述宿主为酵母菌，优选为毕赤酵母GS115 ；所述用于构建所述重组表达载体的出发载体为PPIC9K。本专利技术的有益效果为本专利技术提供的由人生长抑素十四肽和人血清白蛋白组成的融合蛋白中间不加任何连接肽，避免了因连接肽加入而带来的融合蛋白稳定性(避免针对连接肽的蛋白酶降解)和免疫原性等方面的问题；并且其在提高和/或维持天然人生长抑素十四肽的生物活性的基础上，延长了天然人生长抑素十四肽分子在血液循环系统内的滁留时间，改变了其药代动力学特性，从而使该融合蛋白具有临床药用价值；此种融合蛋白可应用于治疗因生长激素分泌过剩所引起的各种疾病，用于治疗胃肠道内分泌紊乱引起的疾病，用于抑制表达SSTRs和不表达SSTRs肿瘤的生长，用于降低胃肠道辐射损伤导致的死亡率。附图说明图1为本专利技术融合蛋白中人生长抑素与人血清白蛋白关联示意图。图 2 为质粒 PPIC9K- (SST-14) 3-HSA/pPIC9K_HSA- (SST-14) 3 结构图。图3为(SST-H)3的重叠PCR产物。图4为HSA的PCR产物。图 5 为融合蛋白(SST-H)3-HSA 和 HSA-(SST-14) 3 的 SDS-PAGE 分析。其中，M:蛋白质分子量标准；Lane 1:重组菌GS115/pPIC9K-(SST_14)3-HSA表达产物；Lane 2:重组菌 GS115/pPIC9K-HSA-(SST_14)3 表达产物。图 6 为融合蛋白(SST-H)3-HSA 和 HSA-(SST-H)3 的 Western blot 鉴定。其中，Lane1:融合蛋白(SST-14)3"HSA ；Lane 2:融合蛋白 HSA_(SST_14)3 图7为融合蛋白(SST-H)3-HSA和(SST-H)3-HSA的分离纯化。其中，M:蛋白质分子量标准；Lane 1:缓冲液B洗脱的融合蛋白(SST-14)3_HSA 的透析产物；Lane 2: 50%乙二醇洗脱的融合蛋白(SST-14)3_HSA的透析产物；Lane 3:缓冲液B洗脱的融合蛋白HSA-(SST-H)3的透析产物；Lane 2: 50%乙二醇洗脱的融合蛋白 HSA-(SST-H)3的透析产物。缓冲液B的洗脱液中含高浓度融合蛋白，纯度在95%以上，冷冻干燥后作为后续药效学研究的样品。50%乙二醇的洗脱液中大部分为融合蛋白的降解产物，表明该亲和柱有较好的分离效果。图8为融合蛋白(SST-H)3-HSA和(SST-14)3_HSA在小鼠体内的药效学检测结果。具体实施例方式下述实施例中的实验方法和所用的试剂，如无特别说明，均为常规方法和常规试剂。质粒抽提试剂盒，DNA胶回收试剂盒，PCR产物纯化试剂盒均购自上海生工生物工程有限公司。pMD19-T Simple Vector, TaKaRa Taq , T本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：付强，杨润林，丁月娣，李文新，范俊，
申请(专利权)人：江苏省原子医学研究所，
类型：发明
国别省市：
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